Fura-2/AM荧光法测定日本血吸虫培养细胞内游离钙离子浓度

目的　研究用钙荧光探剂 (Fura- 2 / AM)检测静息状态下日本血吸虫培养细胞内的游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i) ,以及β-巯基乙醇对培养细胞 [Ca2 + ]i的影响。方法　将 18d虫龄的日本血吸虫童虫制成细胞悬液 ,贴壁法接种于 30 ml培养瓶中 ,培养液为 RPMI- 16 4 0含 2 0 %小牛血清及常量抗生素。在培养的 0 - 3d,制备日本血吸虫细胞悬液 ,采用 Fura- 2 / AM钙荧光探剂测定正常静息状态下及加入β-巯基乙醇后日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i。结果　正常静息状态下 ,培养 0 d的日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i为 188.2 nmol/ L ;培养 1- 3d的 [Ca2 + ]i两两比较差异无显著性(P>0 .0 5 ) ,它们的平均值为 (187.0± 10 .7) nm ol/ L ,与培养 0 d的 [Ca2 + ]i比较 ,差异也无显著性(P>0 .0 5 )。β-巯基乙醇可使日本血吸虫培养细胞内 [Ca2 + ]i明显升高 (P<0 .0 1) ,并随浓度的增加而升高。结论　培养 1- 3d,静息状态下日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i比较稳定 ,β-巯基乙醇能影响日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i     

细胞内游离钙、血压变异性在氯沙坦逆转高血压左心室肥厚中的作用

目的　探讨原发性高血压 ( EH)患者淋巴细胞内胞浆游离钙浓度 ( [Ca2 + ] i)、血压变异性 ( BPV)与氯沙坦逆转高血压左心室肥厚作用的关系。方法　选择 EH患者 60例 ,予氯沙坦治疗 6个月 ,治疗前后检测 [Ca2 + ] i、BPV及左心室重量指数 ( LVMI)。结果　经氯沙坦治疗后 ,EH患者淋巴细胞内 [Ca2 + ] i 从治疗前的 10 2 .3± 11.84nmol/ L降至 84.64± 9.5 2 nmol/ L( P<0 .0 1) ,LVMI从治疗前的 15 5 .69± 2 1.75 g/ m2降至 13 5 .85± 13 .66g/ m2 ( P<0 .0 0 1) ,BPV亦显著下降 ( P<0 .0 1)。 [Ca2 + ] i 的下降幅度与 LVMI的下降幅度呈显著正相关 ( r=0 .6675 ,P<0 .0 5 )。结论　氯沙坦能降低高血压病患者的 BPV,逆转高血压左心室肥厚 ,其逆转左心室肥厚的作用可能与降低血管紧张素 引起的 [Ca2 + ] i 升高有关     

钙调蛋白及其基因表达与先天性心脏病右心室舒张性心力衰竭发病关系的研究

目的探讨先天性心脏病右心室舒张性心力衰竭(DHF)患者心肌细胞内Ca2+超负荷、钙调蛋白及其基因表达的变化.方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blor技术测定10例先天性心脏病右心室DHF患者(DHF组)和6例正常对照(对照组)钙调蛋白及其基因的表达.结果DHF组患者心肌细胞内Ca2+含量较对照组高3倍以上,有非常显著性差异(P<0.01);肌浆网钙-三磷酸腺苷酶(SR Ca2+-ATPase)和细胞膜L型Ca2+通道的信使核糖核酸(mRNA)水平较对照组减低,有显著性差异(P均<0.05),而肌浆网磷酸受纳蛋白、兰尼碱受体和肌集钙蛋白的mRNA表达较对照组无显著性差异;SR Ca2+-ATPase蛋白的相对含量较对照组减低,有显著性差异(P<0.05);磷酸受纳蛋白的相对含量无显著性差异.结论细胞膜L型Ca2+通道和SRCa2+-ATPase基因表达减低是导致先天性心脏病心肌细胞内Ca2+超负荷和右心室DHF发生的主导因素.     

钙结合蛋白S100A12在动脉粥样硬化中的作用

钙结合蛋白S100A12作为具有EF手型结构的S100蛋白家族中的较新一员,有着其独特的结构与功能。人S100A12主要由中性粒细胞表达和分泌,也可被单核细胞及巨噬细胞诱导表达,其通过Ca2+、Zn2+等调节构象变化,结合特异性配体在体内参与多种生理及病理过程。S100A12作为单核细胞趋化剂,活化肥大细胞,在体内形成嗜中性粒细胞和巨噬细胞聚集。因此,S100A12可能对动脉粥样硬化的形成、进展及预后起着非常重要的作用。     

α-11贾第素相互作用蛋白鉴定与验证

目的 鉴定并验证α-11贾第素的相互作用蛋白，为其功能研究提供实验依据。方法 构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交cDNA文库和α-11贾第素诱饵质粒，通过酵母双杂交筛选出可能与α-11贾第素相互作用的蛋白。将α-11贾第素和筛选出的可能互作蛋白基因分别构建入pBiFc-Vc-155、pBiFc-Vn-173质粒，共转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)实验验证两种蛋白的相互作用。结果 构建了库容为2.715×10⁷细菌菌落总数(CFU)的蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交cDNA文库和含有α-11贾第素基因的无自激活活性的诱饵质粒。通过酵母双杂交两轮阳性筛选，共筛选出6个可能与α-11贾第素相互作用的蛋白，分别为真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,EIF5A)、钙调蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase,CAMKL)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸特异性谷氨...     

钙调神经磷酸酶信号通路与心肌细胞肥大

目的　探讨不同来源的细胞内Ca2 ([Ca2 ]i)在钙调神经磷酸酶 (CaN) 活化T细胞核因子 3 (NFAT3 )介导的心肌肥大中的作用。方法　分别用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )或雷尼丁刺激培养的大鼠心肌细胞外Ca2 跨膜内流或细胞内Ca2 释放 ,检测CaN、NFAT3、锌指转录因子 (GATA4)蛋白量、NFAT3定位以及氚 亮氨酸 (3H Leu)掺入量 ,环孢素A作为CaN特异抑制剂。结果　AngⅡ、雷尼丁刺激 1、3d ,心肌细胞CaN、NFAT3、GATA4蛋白表达及3H Leu掺入量较对照组明显增高(P值 <0 0 5或 <0 0 1)。AngⅡ和雷尼丁刺激第 1天 ,心肌细胞NFAT3表达由胞质转入胞核表达为主。环孢素A可抑制上述作用 ,与刺激组相比差异有显著性 (P <0 0 5或 <0 0 1)。结论　刺激心肌细胞Ca2 内流及Ca2 释放 ,均可激活CaN NFAT3信号通路。CaN NFAT3信号通路的激活与[Ca2 ]i增加有关 ,而与 [Ca2 ]i的来源无关。环孢素A能够抑制AngⅡ和雷尼丁介导的CaN NFAT 3 GATA 4表达的增加和蛋白质合成     

舒张性心力衰竭患者Ca2+调控蛋白基因转录和蛋白质表达的研究

目的　探讨心肌细胞内Ca2 超负荷及Ca2 调控蛋白在舒张性心力衰竭 (DHF)患者发生中的作用。方法　采用RT PCR和Westernblot技术测定DHF患者和正常对照组Ca2 调控蛋白mRNA转录和蛋白质表达的变化。结果　与正常组相比 ,DHF患者心肌细胞内Ca2 含量提高 3倍以上 (116 3.88± 5 6 8.6 7vs 2 47.75± 146 .86 ,P <0 .0 1) ;肌浆网 (SR)Ca2 ATPasemRNA水平减低 33.6 4%(0 .71± 0 .19vs 1.0 7± 0 .11,P <0 .0 5 ) ,细胞膜L型Ca2 通道mRNA水平减低 30 .19% (0 .74± 0 .2 0vs1.0 6± 0 .13,P <0 .0 5 ) ,SR磷酸受纳蛋白和兰尼碱受体、肌集钙蛋白的mRNA转录无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;Ca2 ATPase蛋白的相对含量明显低于对照组 (0 .76± 0 .11vs 1.0 1± 0 .0 3,P <0 .0 5 ) ;磷酸受纳蛋白的相对含量无显著性差异 (0 .98± 0 .0 4vs 1.0 0± 0 .0 2 ,P >0 .0 5 )。结论　SRCa2 ATPase基因转录和蛋白质表达减低以及细胞膜L型Ca2 通道基因转录减低是导致心肌细胞内Ca2 超负荷和DHF发生的主要分子机制之一     

幽门螺杆菌cag致病岛ORF10基因下调胃上皮白细胞介素-8转录

目的　幽门螺杆菌 (Hp)cag致病岛 (cagPAI)含 30多个基因 ,HpcagⅠ与cagⅡ中许多基因能增加胃上皮白细胞介素 8(IL 8)基因转录与IL 8蛋白分泌。本研究观察HpcagⅡ中ORF10基因对胃上皮细胞IL 8基因转录的影响 ,以验证HpcagPAI中某些基因下调IL 8基因转录及表达的可能性。方法　构建cagⅡORF10基因缺失 ( ORF10 )Hp突变株及带有IL 8报告基因的人胃癌细胞系L5F11,用液体闪烁计数仪测定荧光素酶 (IL 8转录 )活性 ,用ELISA法测定IL 8蛋白浓度。结果　 3株 ORF10Hp菌株 (2 8 1,2 8 2 ,2 8 3)诱导荧光素酶活性较亲代菌株 2 6 6 95显著增加 [分别为 2 8 1:(1.4 9± 0 .2 7)× 10 6cpm ,2 8 2 :(1.33± 0 .2 8)× 10 6cpm ,2 8 3:(1.33± 0 .2 9)× 10 6cpm ;亲代菌株2 6 6 95 :(0 .6 7± 0 .0 8)× 10 6cpm ;P分别 <0 .0 1,0 .0 5和 0 .0 5 ];2株 ORF10Hp菌株诱导IL 8蛋白水平较亲代菌株 2 6 6 95均显著升高 [分别为 2 8 2 :(1.2± 0 .0 8)ng/ml;2 8 3为 (1.2 4± 0 .0 7)ng/ml;亲代菌株 2 6 6 95为 (0 .33± 0 .19)ng/ml,P <0 .0 5 ,<0 .0 1]。结论　与HpcagⅠ与cagⅡ中大多数基因上调IL 8转录不同 ,cagⅡ中ORF10基因对胃上皮细胞IL 8转录起下调作用     

无血清处理对甲状腺癌TT细胞内S100A13及FGF-1释放机制的初步研究

目的 探讨无血清处理人甲状腺髓样癌细胞(TT细胞)内S100A13及成纤维细胞生长因子1( FGF-1)蛋白释放的机制,初步阐明Ca2+在S100A13及FGF-1蛋白释放过程中的作用.方法 Western印迹检测无血清处理TT细胞S100A13及FGF-1蛋白表达;ELISA检测培养上清液FGF-1蛋白浓度;激光共聚焦显微镜实时动态检测无血清处理TT细胞1h内Ca2+浓度([Ca2+]i)变化;间接免疫荧光观察TT细胞内S100A13及FGF-1蛋白荧光分布.结果 无血清处理TT细胞4h和6h后S100A13及FGF-1蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.0l),而TT细胞培养上清液中FGF-1蛋白浓度升高(P＜0.05或P＜0.01).激光共聚焦Ca2+荧光显像发现无血清处理TT细胞23 min内[Ca2+]i保持相对稳定,23 min后[Ca2+]i迅速上升达到峰值1.6μmol/L,第40 win后下降至一个较低水平,第40 min至第60 min[ Ca2+]i接近0.3～0.6 μmol/L.1h内TT细胞平均[Ca2+]i明显高于正常培养组、EGTA组和BAPTA-AM组.加入钙离子螯合剂EGTA组和BAPTA-AM组TT细胞内的S100A13、FGF-1蛋白表达无明显下降.结论 无血清处理诱导TT细胞内S100A13及FGF-1蛋白的释放与[Ca2+]i变化有关;Ca2+螯合剂EGTA、BAPTA-AM能有效拮抗无血清处理引起的TT细胞[Ca2+]i升高,并抑制S100A13及FGF-1蛋白的释放.     

凋亡素基因治疗系统对人肝癌细胞的影响

原发性肝癌的治疗是临床工作中的难题之一 ,近年来的研究表明 ,基因治疗可能是恶性肿瘤治疗的一条新途径。凋亡素基因是鸡贫血病毒基因组中一个编码基因序列[1] ,由其编码的蛋白为凋亡素 (VP3) [2 ] ,通过合适的载体将凋亡素基因导入靶细胞 ,其编码的凋亡素能特异地诱导肿瘤细胞凋亡。本研究旨在构建凋亡素基因治疗系统 ,并观察其对人肝癌细胞HepG2的影响。一、实验方法1.实验分组 :( 1)HepG2 /增强型绿荧光蛋白 (EGFP)组 ;( 2 )HepG2 /EGFP VP3组 ;( 3)HepG2组。2 .细胞培养 :HepG2细胞以含 10 %胎牛血清的R16 4 0培养液 37℃、5…