白介素2基因佐剂协同HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导小鼠免疫应答

目的 研究白介素2(IL-2)cDNA协同HSV-2多表位复合DNA疫苗免疫对小鼠体液和细胞免疫应答的影响.方法 利用真核表达质粒pcDNA3.1分别构建HSV-2糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP27的多表位复合DNA疫苗HV-pcDNA3.1和IL-2的真核表达质粒IL-2-pcDNA3.1.15只C57/BL6小鼠分为3组,分别接受pcDNA3.1空载体注射、HV-pcDNA3.1单独免疫或HV-pcDNA3.1及IL-2-pcDNA3.1联合免疫.共免疫2次,间隔2周.末次免疫3周后.ELISA法检测小鼠血清HSV-2特异性IgG、IL-2和IFN-γ,淋巴细胞特异性增殖反应和乳酸脱氢酶法检测杀伤性T淋巴细胞(CTL)功能.结果 与HV-pcDNA3.1单独免疫组相比.IL-2-pcDNA3.1的协同免疫可以提高小鼠血清中和IFN-γ表达(1956.19±219.60ng/L,P<0.05),增强淋巴细胞特异性增殖反应(促细胞增殖率为2.75%±0.26%,P<0.05)和CTL活性(47.91%±15.09%,P<0.05).小鼠血清HSV-2特异性IL-2水平在协同免疫组为(1421.16±220.98)ng/L,HV-pcDNA3.1单独免疫组为(1246.84±157.02)ng/L.两组间差异无统计学意义.结论 IL-2cDNA的协同免疫可以显著提高HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导的细胞免疫应答水平.     

信号肽序列修饰的单纯疱疹病毒-2多表位复合DNA疫苗构建

目的:构建经糖蛋白gD信号肽修饰的单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP 27的多表位复合DNA疫苗.方法:国内HSV-2野生株经测序与PCR鉴定后利用PCR技术从其基因组中扩增出HSV-2 ICP27 377-459、gD146-179、gD223-306、gB529-606、gC247-282、gD1-77 6个基因片段,PCR鉴定后按先后顺序,采用多基因片段一步酶切连接法获得HV融合基因片段,经pGEMT载体克隆后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1载体中,构建出重组真核表达质粒HV-pcDNA3.1,并对其进行酶切分析及测序鉴定.PCR扩增gD146-179信号肽片段,进一步酶切连接构建重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1,并对其进行测序鉴定.结果:酶切重组质粒HV-pcDNA3.1,电泳可见两条带,分别为融合基因HV(1.3 kb)和线性质粒pcDNA3.1(5.4 kb).测序结果表明,克隆基因插入方向正确,重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1与GenBank HSV-2中相关序列同源性达99.9%.结论:成功构建了经糖蛋白gD信号肽修饰的HSV-2多表位复合DNA疫苗.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型细胞毒性T淋巴细胞表位重组DNA疫苗的构建表达及鉴定

目的：针对单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）包膜糖蛋白gD和gB的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）表位,构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。方法：用PCR方法从已构建好的pc-gD真核表达质粒中扩增gD片段,将其与CTL表位共同连接到pVAX1载体,构建重组真核表达质粒pVAX-gD-CTL。采用免疫组化和Western-blotting法鉴定重组质粒的表达情况,免疫BALB／c小鼠,进行CTL活性鉴定。结果：构建的重组质粒能在非洲绿猴肾细胞（COS-7细胞）内表达。该重组DNA疫苗免疫接种BALB／c小鼠后,其CTL活性增高。结论：成功构建HSV-2 pVAX-gD-CTL重组真核表达质粒,并能在真核细胞内表达,该DNA疫苗对细胞免疫有明显的促进作用。     

人乳头瘤病毒11型DNA疫苗协同CD80基因诱导小鼠特异性免疫反应

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)11E7、L1-E7DNA疫苗质粒协同共刺激分子CD80诱导的特异性免疫反应.方法 将所构建的pcDNA3.1(+)/HPV11E7、E7-CD80、L1-E7DNA疫苗质粒分别经肌内注射免疫小鼠,并设L1-E7质粒与CD80质粒共同注射组,PCR和RT-PCR检测质粒DNA的组织分布和目的基因RNA转录,MTT法测脾淋巴细胞增殖活性,ELISA检测脾淋巴细胞培养上清细胞因子的表达水平及血清抗体的水平.结果 免疫小鼠后,质粒主要分布在注射部位.DNA疫苗诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ增加,产生HPV11E7 IgG/L1 IgG抗体;与CD80基因嵌合后,脾淋巴细胞增殖和分泌活性显著增强;与CD80联合免疫组所诱导的细胞免疫反应和体液免疫均显著强于L1-E7单独免疫组.结论 HPV11DNA疫苗能诱导小鼠产生特异性免疫反应,CD80可加强其免疫效果.     

单纯疱疹病毒II型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究

目的探讨单纯疱疹病毒II型(HSV-2)CTL表位疫苗对小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响。方法用构建的HSV-2pVAX-gD-CTL重组质粒免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gDIgG水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中INF-γ,IL-4水平;流式细胞仪测定小鼠CD4+,CD8+T淋巴细胞亚群。结果HSV-2pVAX-gD-CTL疫苗免疫小鼠后可以诱导脾淋巴细胞增殖及分泌INF-γ和IL-4,诱导CD4+,CD8+T细胞百分比的升高;并能刺激血清HSV-2gD特异性抗体的产生。其中pVAX-gD-CTL组在脾淋巴细胞刺激指数及其分泌INF-γ水平、CD4+,CD8+T细胞百分比升高方面均显著高于pVAX-gD对照组。结论CTL表位对单纯疱疹II型重组DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答有促进作用。     

脂质体包裹HSV-2gD-HSP70融合蛋白诱导小鼠免疫应答的研究

目的 探讨局部外用脂质体包裹单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)与结核杆菌热休克蛋白(heat shock protein,HSP)70融合蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生特异性免疫应答的情况。方法 局部外用脂质体包裹gD,gD+HSP70,HSP70-gD融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠3周,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gD IgG水平,同时分离小鼠脾淋巴细胞,并用HSV-2gD蛋白刺激,用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况及ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素4(IL-4)水平。结果 脂质体包裹gD、gD+HSP70和HSP70-gD均可以诱导小鼠产生针对HSV-2gD蛋白的抗体并诱导脾淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ和IL-4,脂质体包裹HSP70-gD组在血清抗体水平、脾淋巴细胞刺激指数及其分泌IFN-γ、IL-4水平方面均显著高于脂质体包裹gD+HSP70组和gD组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HSP70可以促进gD蛋白诱导小鼠特异性免疫应答反应。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究

目的探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）CTL表位疫苗对小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响。方法用构建的HSV-2pVAX-gD-CTL重组质粒免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gDIgG水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中INF-γ,IL-4水平;流式细胞仪测定小鼠CD4^＋,CD8^＋T淋巴细胞亚群。结果HSV-2pVAX-gD-CTL疫苗免疫小鼠后可以诱导脾淋巴细胞增殖及分泌INF-γ和IL-4,诱导CD4^＋,CD8^＋T细胞百分比的升高;并能刺激血清HSV-2gD特异性抗体的产生。其中pVAX-gD-CTL组在脾淋巴细胞刺激指数及其分泌INF-γ水平、CD4^＋,CD8^＋T细胞百分比升高方面均显著高于pVAX-gD对照组。结论CTL表位对单纯疱疹Ⅱ型重组DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答有促进作用。     

梅毒螺旋体融合双价DNA疫苗的构建及其免疫活性研究

目的 构建含有梅毒螺旋体Gpd和Tp92抗原编码基因的真核表达重组体,并检测其在兔体内的免疫应答效果。方法 定向克隆构建双基因融合真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92,用免疫组化技术检测其在HeLa细胞中的表达;同时将其与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd、pcDNA3.1(+)/Tp92真核表达重组体分别免疫新西兰兔,ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IFN-γ诱导水平,MTT法检测兔脾细胞增殖水平。结果 pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92在HeLa细胞中能有效表达。新西兰兔分别接种3种核酸疫苗后,均能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度均可达1:1024及以上,免疫后兔脾细胞受相应蛋白刺激有明显增殖反应,细胞培养上清中IFN-γ水平显著升高。检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P<0.05)。3组核酸疫苗组抗体诱导水平差异无统计学意义,但Gpd-Tp92融合核酸疫苗组刺激机体引发特异性淋巴细胞增殖能力较之两单基因核酸疫苗组有明显提高。结论 梅毒螺旋体真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92的成功构建及对新西兰兔产生强特异免疫应答的有效刺激,为梅毒DNA疫苗的研究奠定一定的实验基础。     

钙网蛋白基因120片段和人乳头瘤病毒6bE7基因诱导的小鼠细胞免疫反应

目的研究嵌合DNA疫苗钙网蛋白基因120片段(CRT120)和人乳头瘤病毒6b型E7基因(HPV6bE7)的免疫学特性。方法克隆、构建重组质粒即嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／ HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-CRT120;经脂质体转染获得HPV6bE7转染阳性 B16细胞株;用肌内注射法对C57BL/6小鼠进行重组质粒DNA疫苗免疫;检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群变化、小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性以及与靶细胞共孵育后白介素2和干扰素γ的分泌水平。结果获得构建正确的嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／HPV6bE7以及稳定表达HPV6bE7 的阳性细胞株。CRT120／HPV6bE7较之HPV6bE7能引起免疫小鼠外周血中CD8 T淋巴细胞亚群分化和 TCRγδ T细胞上调(P<0．05),脾淋巴细胞与靶细胞共孵育上清液中白介素2和干扰素γ的浓度也明显高于HPV6bE7和CRT120组(P<0．05);CRT120／HPV6bE7免疫的小鼠淋巴细胞对靶细胞B16／HPV6bE7 有明显的杀伤活性。结论 CRT120／HPV6bE7嵌合DNA疫苗能够诱导免疫小鼠的病毒抗原特异性细胞免疫。     

白介素2与梅毒螺旋体膜蛋白Gpd双价核酸疫苗的免疫活性及保护作用研究

目的 探讨白介素2(IL-2)基因与梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Gpd抗原编码基因融合构建双价核酸疫苗免疫新西兰兔后的免疫应答效果及感染Tp后的保护作用.方法 定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2,与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd真核表达重组体分别设为两个疫苗实验组,同时设pcDNA3.1(+)空质粒对照组及PBS对照组,共4组,每组18只雄性新西兰兔,肌肉多点注射初次免疫,于初次免疫后第10周各实验组兔皮下接种Tp标准株进行感染实验,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同时间点免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IL-2及干扰素γ(IFN-γ)诱导水平,噻唑蓝法检测兔脾淋巴细胞增殖水平.结果 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2融合双价疫苗和pcDNA3.1(+)/Gpd单基因疫苗在免疫期间和感染期间均能检测到高滴度的IgG特异性抗体,最高滴度分别可达1∶4096和1∶1024(P值均＜0.01);两疫苗组之间在免疫及感染期间不同时间点比较差异也有统计学意义(P值均＜ 0.01);免疫后第8周双价融合核酸疫苗组及单基因核酸疫苗组兔脾细胞培养上清中IFN-γ分别为(447±22.4)μg/L、(225±17.6)μg/L,IL-2分别为(167±15.7)μg/L、(110±12.6)μg/L,均高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01);感染期间不同时间点兔脾细胞受相应蛋白刺激均有明显增殖反应,检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01).早期感染皮损观察显示双价融合核酸疫苗组较之单基因疫苗组有着更低的皮损Tp检测阳性率(17.5％)、溃疡病灶发生率(15％)以及更短的皮损愈合时间.结论 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2双基因融合疫苗在兔体内能更有效地诱导保护性体液免疫和细胞免疫应答.     

单纯疱疹病毒2 gD基因的树突细胞疫苗免疫效应研究

【摘要】 目的 观察单纯疱疹病毒2 gD（HSV-2 gD）基因的树突细胞（DC）疫苗在动物实验中诱发特异性免疫应答情况。 方法 用腺病毒介导的、HSV-2 gD基因修饰的DC（pAdeno-HSV-2 gD-DC）疫苗免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第10天检测小鼠血清中gD IgG水平;同时,分离小鼠脾淋巴细胞,用HSV-2gD蛋白刺激,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况、乳酸脱氢酶释放法测定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性及ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中干扰素γ（IFN-γ）、白介素4（IL-4）水平。实验分为4组,pAdeno-DC组、pAdeno-HSV-2 gD-DC组、DC组、空白对照组,每组10只。 结果 pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠血清内可检测到高滴度针对HSV-2gD蛋白的抗体（A450值为0.313 ± 0.034）,与pAdeno-DC组（0.034 ± 0.009）、DC组（0.028 ± 0.009）、空白对照组（0.026 ± 0.010）比较,差异有统计学意义（P < 0.05）。pAdeno-HSV-2 gD-DC可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖（刺激指数为1.600 ± 0.215）、有效杀伤靶细胞（CTL活性为37.1%）,与pAdeno-DC组（分别为1.063 ± 0.070和16.0%）、DC组（1.056 ± 0.063和14.9%）、空白对照组（1.020 ± 0.051和15.7%）比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）。pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠分离的脾细胞培养上清可以检测到高水平IFN-γ（A450值为0.568 ± 0.031）和IL-4（A450值为0.544 ± 0.043）,与pAdeno-DC组（0.266 ± 0.021和0.278 ± 0.037）、DC组（0.271 ± 0.023和0.275 ± 0.044）、空白对照组（0.252 ± 0.012和0.245 ± 0.051）比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 构建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以在小鼠中产生较强的特异性免疫应答。     

基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的不同接种策略

目的 评估基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的各接种优化策略对新西兰兔梅毒螺旋体(Tp)皮肤感染的免疫保护效应.方法 核酸疫苗pcD/Tp92采用2次肌内注射免疫或肌内注射初免鼻饲加强的免疫方式结合黏膜佐剂CpG ODN及Tp92重组蛋白,分别或联合免疫新西兰兔.酶联免疫吸附法(ELISA)检测各接种策略组免疫期间(0~8周)兔特异性抗体产生及变化水平,免疫8周后兔鼻咽部、阴道黏膜SIgA产生水平及兔脾细胞IL-2、γ干扰素(IFN-γ)诱导水平,噻唑蓝法(MTT)检测兔脾淋巴细胞增殖水平.记录各组在初次免疫后第10周兔皮下接种Tp标准株感染后接种部位感染早期皮损的变化.结果 采用pcD/Tp92核酸疫苗肌内注射初免,CpG-ODN联合Tp92重组蛋白抗原鼻饲新西兰兔加强免疫的接种策略组(C2组)分别与pcD/Tp92疫苗肌注组(A2组),pcD/Tp92疫苗肌注初免,pcD/Tp92鼻饲加强免疫组(B1组)或结合黏膜佐剂CpG ODN联合免疫的接种策略组(B2组)相比,既能促进pcD/Tp92核酸疫苗在兔体内免疫期间(8周)诱生更高特异性抗体水平(C2组:1.825±0.175;A2组:1.372±0.322;B1组:0.893±0.297;B2组:1.294±0.124;P<0.05),IL-2(C2组:154.7±14.6;A2组:112.3±13.4;B1组:76.6±21.5;B2组:97.3±18.7;P<0.05)及IFN-γ(C2组:277.4±24.4;A2组:232.8±25.3;B1组:165.7±22.6;B2组:211.3±24.6;P<0.05)分泌水平,以及更高的T细胞增殖分化水平(SI C2组:3.57±0.24;A2组:3.08±0.22;B1组:2.12±0.14;B2组:2.88±0.18;P<0.05),还能刺激更高的黏膜特异性SIgA抗体,导致最低Tp感染部位皮损Tp阳性率(6.67%)及溃疡病灶形成率(6.67%)从而达到有效的保护作用.结论 pcD/Tp92核酸疫苗肌内注射初免,CpG ODN联合Tp92重组蛋白鼻饲加强免疫的接种策略能在新西兰兔体内诱导最强的黏膜免疫和免疫保护效应.     

副肿瘤性天疱疮抗Dsg1和抗Dsg3抗体滴度及亚型和细胞因子的表达

目的对不同病期的副肿瘤性天疱疮(PNP)患者血清中抗桥粒芯糖蛋白(Dsg)1和抗Dsg3抗体的滴度、亚型及其外周血单个核细胞(PBMC)中细胞因子IFN-γ和IL-4水平进行观察,探讨PNP的特殊发病机制。方法采用ELISA法检测6例PNP患者不同病期抗Dsg1和抗Dsg3抗体滴度及其IgG1和IgG4抗体亚型;采用流式细胞术(FCM)检测上述患者PBMC中T细胞的IFN-γ和IL-4水平,并与10例寻常型天疱疮(PV)患者、10例落叶型天疱疮(PF)患者及20例正常对照进行比较。结果 PNP患者组在急性期抗Dsg1和抗Dsg3抗体滴度均升高,稳定期均明显降低,抗Dsg1和抗Dsg3抗体亚型IgG1/IgG4均以IgG1为主,与PV组相比,差异均有统计学意义(P均<0.05),与PF组患者的抗Dsg1抗体亚型IgG1/IgG4比较,差异也有统计学意义(P<0.01);PNP组患者CD8+T细胞及CD4+T细胞内IFN-γ水平明显高于PV组患者和PF组患者(P=0.001),且稳定期CD8+T细胞及CD4+T细胞内IFN-γ水平较急性期明显降低(P<0.05)。PNP组急性期患者的CD4+T细胞内IL-4水平显著低于PV组患者(P<0.05)和PF组患者(P<0.01),但在稳定期时,其水平与急性期比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PNP患者在抗Dsg1和Dsg3抗体的亚型、细胞因子等方面与其他类型的天疱疮存在明显差异。