PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的　建立卡氏肺孢子虫 (P.c )DNA的聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。　方法　实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。　结果　两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96.4% (27/28)和100% (28/28)。Giemsa染色镜检P.c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各10份标本 ,均有1只大鼠阳性。　结论　PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。     

卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型的比较研究

目的　比较用SpragueDawley(SD)大鼠和Wistar大鼠建立卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)模型的差异。 方法　选用SD大鼠和Wistar大鼠 ,随机分为实验组和对照组 ,免疫抑制诱导建立动物模型 ;收集肺组织和支气管肺泡灌洗液 (BALF) ,分别制成肺印片和BALF涂片 ,作Giemsa染色 ,镜检卡氏肺孢子虫滋养体和包囊。结果　共收集实验组SD大鼠和Wistar大鼠的肺组织及BALF标本各 2 8份 ,经Giemsa染色后 ,在肺印片中查见Pneumocystiscarinii(Pc)虫体的阳性率分别为 89.2 9%和10 0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;BALF阳性率分别为 6 0 .71%和 78.5 7% ,两者之间亦无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而同种大鼠的肺印片与BALF涂片 ,其阳性率之间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,且肺印片的检出率均显著高于BALF涂片。同种大鼠不同肺叶的肺印片 ,其阳性率之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　SD大鼠与Wistar大鼠作为PCP模型动物无明显差别     

PCR技术对大鼠卡氏肺孢子虫DNA的检测

目的　探讨诊断卡氏肺孢子虫感染的最佳方法。方法　建立大鼠动物模型,肺涂片用吉氏染色法查肺孢子虫包囊,支气管灌洗液、肺组织和血液标本,用ＰＣＲ技术进行卡氏肺孢子虫ＤＮＡ的检测,共计实验组大鼠１２ 只及对照组８ 只。结果　实验组大鼠,吉氏染色法卡氏肺孢子虫包囊检出率为６６－７％ ,ＰＣＲ技术支气管灌洗液、肺组织和血液标本,卡氏肺孢子虫ＤＮＡ检出率分别为８１－８ ％ 、５０％ 和５０％ 。比肺印片提前２ 周检出。对照组大鼠,吉氏染色法未检出卡氏肺孢子虫包囊,在支气管灌洗液和血液标本中,ＰＣＲ技术测出了卡氏肺孢子虫ＤＮＡ。结论　在血液标本中ＰＣＲ的成功应用,为卡氏肺孢子虫感染的流行病学调查及人类卡氏肺孢子虫肺炎的诊断,提供了一种有用的、非创伤性的方法。     

肺孢子虫感染大鼠模型的建立及ITS巢式PCR检测敏感性研究

目的 建立肺孢子虫感染大鼠模型并探讨ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫DNA的敏感性. 方法 大鼠分为实验组和对照组,实验组从第1周开始用每周2次每次每只皮下注射地塞米松1 mg的方法诱导,共8周,并分别在首次注射后第2、4、6、8周解剖大鼠制作肺印片、肺组织匀浆液及支气管肺泡灌洗液(BAL)涂片,并进行六亚甲基四胺银(Gomori's methenamine silver,GMS)染色镜检;对照组不作激素注射,并分别在0周和第10周剖杀染色检查.同时分别提取大鼠BAL和肺组织的肺孢子虫DNA进行巢式PCR扩增,比较GMS法和ITS巢式PCR检测的敏感性. 结果 实验组从第6周开始染色镜检,可见少量肺孢子虫包囊,第8周肺印片、肺组织匀浆液均检测到包囊,检出率为100%(10/10),BAL的检出率为80%(8/10),对照组则均未检出.用ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR法均能检测出实验组第8周大鼠BAL和肺组织卡氏肺孢子虫DNA,阳性率为100%(10/10),对照组均为阴性.比较BAL标本、肺印片和肺组织匀浆液GMS染色法的检出率,BAL最低,肺组织匀浆液最高.其中20%(2/10)大鼠的BAL标本用GMS染色法未能检出,但用巢式PCR方法均能成功扩增.结论成功用地塞米松诱导法建立了肺孢子虫大鼠感染模型;ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫敏感性高、特异性强,可推广应用于临床诊断肺孢子虫肺炎.     

用半巢式PCR检测无创性标本诊断卡氏肺孢子虫肺炎的实验研究

目的无创性诊断卡氏肺施子虫肺炎。方法采用一对半引物进行半巢式DHFR－PCR检测实验大鼠无创性标本——支气管液、血清及活检标本——肺及肝脏组织中的卡氏肺孢子虫DNA。结果从59只经病理学检查证实的卡氏肺孢子虫肺炎大鼠中采集到的上述4种标本，卡氏肺孢子虫DNA的半巢式DHFR－PCR检出率分别为72.7％（32／44），37.3％（22／59），94．9％（56／59）和36．4％（8／22），而DHFR－PCR的检出率则仅为25％，13．6％，71．2％和9．1％。12只轻度感染的PCP大鼠的无创性标本中卡氏肺孢子虫DNA的检出率由刚提高至41．7％。正常鼠标本及各种病原体对照的半巢式DHFR－PCR均为阴性。结论用半巢式DHFR－PCR无创性地诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎具有敏感、特异、省时、省力等优点；本文在血和肝中检出卡氏肺孢子虫DNA，提示在卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型中存在虫血症和肺外卡氏肺孢子虫感染。     

大鼠卡氏肺孢子虫的三个基因序列分析

目的 分析我国大鼠源卡氏肺孢子虫的基因序列特征。方法：以Wistar大鼠建立肺孢子虫肺炎动物模型,收集鼠肺,抽提DNA,以PCR方法扩增卡氏肺孢子虫的5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因（mtLSU rRNA）、胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因（TS）。纯化扩增产物,直接测序。检索基因库（GenBank）,进行序列比较。结果 三个基因的PCR扩增呈阳性。感染Wistar大鼠的卡氏肺孢子虫5S rRNA基因与gb|S78185|S78185、gb|M28193|PMCRAA两个序列同源性分别为93.3%和91.7%;mtLSU rRNA基因与gb|U20173|PCU20173 、gb|U20169|PCU20169两个序列同源性分别为76.2%和55.2%;TS基因与gb|M25415|PMCTHYSY、gb|S77510|S77510两个序列同源性均为90.9%。结论 Wistar大鼠感染的卡氏肺孢子虫的三个基因与GenBank内的相应基因序列同源性较高。     

卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用

目的制备特异、敏感的卡氏肺孢子虫(Pc)DNA探针,用于检测卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)患者临床标本中的PcDNA。方法PCR扩增获得Pc的线粒体核糖体RNA大亚基基因,以其为模板,采用随机引物法制备半抗原地高辛标记的探针。检测探针的敏感性和特异性后,用斑点杂交法检测实验大鼠肺组织和PCP患者临床标本中的PcDNA。结果敏感性检测显示该探针可检出2pg水平的PcDNA,特异性检测显示该探针仅与PcDNA杂交,而不与伯氏疟原虫、恶性疟原虫、弓形虫、人白细胞及正常大鼠肺组织DNA反应。斑点杂交检测PCP大鼠肺组织中的PcDNA,检出率为73.7%,低于PCR结合斑点杂交的检出率94.7%。用该探针从1例肾移植术并发PCP患者的支气管肺泡灌洗液中检测到PcDNA。结论制备的PcDNA探针具有敏感性高、特异性好、无放射性污染等优点,对PcDNA有良好的检测效果。     

聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本对卡氏肺孢子虫肺炎的诊断价值

目的 评价聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本中卡氏肺孢子虫DNA对卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）的诊断意义。方法 分别用姬姆萨和六胺银（GMS）两种染色方法和mt-rRNA-PCR方法检测痰液中的卡氏肺孢子虫。结果 化学染色法检测16例临床拟诊PCP的患者痰标本。结果 8例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,化学染色方法的敏感性和特异性分别为50％和100％。PCR方法检测16例临床拟诊PCP患者痰液中卡氏肺孢子虫,14例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,mt-rRNA-PCR方法的敏感性和特异性分别为88％和100％。结论 姬姆萨和GMS两种细胞化学染色方法联合检测痰标本卡氏肺孢子虫,特异性高,但敏感性偏低。mt-rRNA-PCR检测痰标本中卡氏肺孢子虫DNA方法敏感性高于化学染色法且特异性高,更适于临床应用。     

SPA-ELISA检测卡氏肺孢子虫抗原的研究

目的 探讨SPAK-ELISA检测卡氏肺孢子虫抗原对诊断卡氏肺孢子虫肺炎的价值。 方法 采用SPA-ELISA检测免疫抑制大鼠模型在不同时期肺泡灌洗液(BALF)和血清中肺孢子虫(PC)抗原,以及造血干细胞移植并发肺炎患者痰液和血清抗原,并与病原学检查结果比较。 结果 感染大鼠于用药后第4周,BALF中PC抗原,以及肺组织印片和BALF涂片包囊检查开始出现阳性,但前者阳性率(60％)高于后者(20％和40％),而且全部阳性达到的时间(8周)也早于后者(10周)。第10周有2只鼠血清抗原阳性,但此后又转阴。30例肺炎患者痰液抗原阳性8例,阳性率为26.67％,8例抗原阳性患者中只有3例发现包囊,符合率为37.5％。血清抗原检测全部阴性。 结论 SPA-ELISA检测痰液和肺泡灌洗液抗原比病原学检查敏感性高,而检测血清抗原不适用于诊断卡氏肺孢子虫肺炎。     

SPA-ELISA检测卡氏肺孢子虫抗原的研究

目的探讨SPAK-ELISA检测卡氏肺孢子虫抗原对诊断卡氏肺孢子虫肺炎的价值。方法采用SPAELISA检测免疫抑制大鼠模型在不同时期肺泡灌洗液(BALF)和血清中肺孢子虫(PC)抗原，以及造血干细胞移植并发肺炎患者痰液和血清抗原，并与病原学检查结果比较。结果感染大鼠于用药后第4周，BALF中PC抗原，以及肺组织印片和BALF涂片包囊检查开始出现阳性，但前者阳性率(60％)高于后者(20％和40％)，而且全部阳性达到的时间(8周)也早于后者(10周)。第10周有2只鼠血清抗原阳性，但此后又转阴。30例肺炎患者痰液抗原阳性8例，阳性率为26．67％，8例抗原阳性患者中只有3例发现包囊，符合率为37．5％。血清抗原检测全部阴性。结论SPA—ELISA检测痰液和肺泡灌洗液抗原比病原学检查敏感性高，而检测血清抗原不适用于诊断卡氏肺孢子虫肺炎。     

肺孢子菌动物模型的建立及病原学和分子生物学检测技术研究

目的 目的 建立肺孢子菌动物模型, 并对肺孢子菌病原学和分子生物学检测技术进行研究。方法 方法 SD和Wistar大 鼠随机分为实验组和对照组, 实验组大鼠皮下注射地塞米松, 对照组皮下注射生理盐水。诱导8周后处死全部大鼠, 收 集其支气管肺泡灌洗液 （BALF） 和肺组织, 分别做涂片和肺印片, 染色后镜检。用FTA卡采集所有大鼠的BALF进行PCR 检测。对PCR产物进行测序, 利用BLAST软件将测序结果与GenBank数据库中的鼠源性肺孢子菌进行比对, 确定菌 种。结果 结果 共采集肺组织标本和BALF 各34份, 病原学检测显示实验组总感染率为29.2% （7/24）, 对照组感染率为0; 其 中SD和Wistar大鼠实验组感染率分别为25.0% （3/12） 和33.3% （4/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.31）; 实验组SD大鼠肺印 片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别为25.0% （3/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.34）。实验组Wistar大鼠 肺印片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别33.3% （4/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.24）。用PCR方法共检 测28份大鼠BALF样本, 实验组阳性检出率为91.7% （26/28）, 对照组均为阴性。对PCR产物进行测序分析, 发现其与 GenBank 已登录的大鼠源肺孢子菌 （JX499145、 GU133622、 EF646865） 的同源性均为100%。结论 结论 通过皮下注射地塞米 松可以建立肺孢子菌动物模型, SD大鼠与Wistar大鼠在作为肺孢子菌动物模型的选择上无显著差别。在早期感染阶 段, 适宜用PCR法进行肺孢子菌检测, 病原形态学检测漏检率高。     

实验动物肺孢子菌隐性感染状况调查

目的调查实验动物肺内肺孢子菌隐性感染情况,为其质量监测及选择标准提供依据。方法从本校实验动物部培育的3种6个品系普通级实验动物中随机抽取大鼠、小鼠和兔,取肺脏制成印片标本,分别用姬姆萨(Giemsa)和改良的六亚甲基四胺银(GMS)染色,镜检肺孢子菌的包囊型和滋养体型;用PCR方法检测肺孢子菌特异性DNA。结果①大鼠Giem-sa染色和改良的GMS法阳性率分别为22.6%(12/53)和30.2%(16/53);PCR检测阳性率为49.1%(26/53)。②小鼠Giemsa染色检查全为阴性;GMS染色法检查阳性率为8.5%(8/94)。③用Giemsa和GMS染色检查日本大耳白兔,结果全为阴性。④对比3种动物不同品系的肺孢子菌感染率,GMS染色大鼠、小鼠两者差异显著(P<0.05)。Wistar和SD两种品系大鼠间无显著性差异(P>0.05);昆明株,BALB/c和C57BL/6三个品系小鼠间感染率无显著性差异(P>0.05)。⑤3种检查方法对比:PCR,GMS和Giemsa的阳性率分别为49.1%(26/53),13.6%(24/177)和6.8%(12/177),三者间检出率存在显著性差异(P<0.05)。结论肺孢子菌在普通级实验大鼠及小鼠体内的隐性感染现象较为普遍,其中大鼠的感染率明显高于小鼠。PCR灵敏性高于Giemsa和GMS染色法。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段的克隆与分析

目的建立卡氏肺孢子虫动物模型,体外扩增卡氏肺孢子虫MSG基因部分片段,方法取肺孢子虫肺炎大鼠肺组织制备卡氏肺孢子虫(Pc)DNA,并以此模板扩增MSG基因片段,将PCR产物与pGEM-T-easy载体连接,转化E.coli DH5a,在含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上筛选出重组子,提取重组质粒,并通过PCR、酶切及测序验证,并进行序列比较分析;结果PCR扩增获得长度为554bp的序列,测序结果与报道的基因序列相比,碱基序列完全相同。结论本研究从卡氏肺孢子虫DNA中成功获得MSG基因,MSG基因的克隆,为进一步开展MSG蛋白致病机制、基因工程疫苗等研究奠定基础。     

巢式PCR早期检测实验大鼠卡氏肺孢子虫

目的 探讨ITS1-5.8S rRNA-ITS2巢式PCR法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性及早期检测的评估.方法 采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫,大鼠分为7组,6组实验组和1组对照组,每组10只,实验组采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫,对照组则不予激素处理.自诱导开始第3周至第8周每周收集1组实验组...