脑胶质瘤患者全长新基因的获得及初步研究

目的 探讨基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中一条基因进行初步研究。方法 抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察两者表达谱的差异情况,对507E08克隆子进行了Northern印迹、原位杂交、生物信息学分析和染色体定位。结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern印迹证实507E08基因在人正常脑组织中低表达,而在人脑胶质瘤中高表达。原位杂交得到相同的结果。BLASTn和BLASTx分析显示,507E08基因为全长新基因,长度为2002bp,共编码203个氨基酸。本基因命名为人核糖体蛋白L14．22。该基因定位于14号染色体上D14S1066和D14S265Marker之间。结论 用基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因,具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性。507E08基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因。     

cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene

Background This investigation was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and the characterization of one novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma tissues and normal brain tissues, and mRNA was used to make probes. After hybridization and washing, the results were scanned using a computer system. The gene named 681F05 clone was an expressed gene to human glioma through four-time hybridization and scanning. Subsequently northern blot analysis was performed by northern blot, 5‘RACE and bioinformatics. Results Fifteen differentially expressed genes to human glioma were obtained through four-time hybridization and scanning. Northern blot analysis confirmed that 681F05 clone was low-expressed in human brain tissues and over-expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that 681F05 clone is two cDNA clones encoding two novel proteins that are highly identified to the cyclophilin isoform 10 of C. Elgans, respectively. Sequence analysis revealed the two cDNA clones are two different splicing variants of a novel cycophilin-like gene (PPIL3a and PPIL3b). Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human PPIL3 may be correlated with the formation of human glioma.     

脑胶质瘤相关新基因PKIβ的表达与蛋白质性质的研究

目的 运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中1条基因进行了克隆和表达.方法 抽提正常成人脑组织与脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察二者表达谱的差异情况,对436F11克隆子进行Northern印迹,生物信息学分析和蛋白质的表达.结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern印迹证实436F11基因在人正常脑组织中高表达,而在人脑胶质瘤中低表达.BLASTn和BLASTx分析显示,436F11基因为全长新基因,共编码78个氨基酸,其理论相对分子质量为8468等电点为4.69,与鼠PKIβ69%同源,命名为人PKIβ.并在大肠杆菌中得到了PKIβ较高的表达蛋白,经纯化,在SDS-PAGE胶上获得了1条清晰的条带.氨基酸测序和分子量测定与生物信息学结果完全一致.结论 基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性.人PKIβ可能是与人脑胶质瘤形成有关的1条全长新基因,这为脑胶质瘤的基因治疗提供了一条新思路.     

人LNX新基因克隆及组织分布和在脑胶质瘤中的表达

目的探讨人脑胶质瘤相关LNX新基因克隆、组织分布和在不同级别星形细胞瘤中的表达及其参与胶质瘤信号途径的分子机制。方法构建胎脑cDNA文库并测序获得全长LNX新基因;人多组织文库（MTC）为模板研究LNX的正常人体组织分布;应用含13939种人类基因表达谱芯片检测LNX新基因在脑星形细胞瘤中的表达;Northern杂交验证LNX新基因在不同级别胶质瘤中的表达;酵母双杂交研究与LNX新基因相互作用的蛋白,应用免疫共沉淀方法验证LNX与Numb蛋白和SKIP蛋白的相互作用。结果人胎脑文库中克隆的LNX新基因长约3．7kb,含1899bp开放阅读框,编码632氨基酸蛋白,相对分子质量约70000,登录号AF237782;LNX新基因在脑、肾和胰腺中表达较高,在心、胎盘、肺、肝、脾、胸腺和前列腺中也有表达;但LNX在胶质瘤组织中表达均降低,与肿瘤发生密切相关;酵母双杂交筛选到LNX新基因与肿瘤Notch信号途径中的Numb和SKIP蛋白有相互作用,免疫共沉淀发现LNX新基因与SKIP蛋白相互作用,可影响Numb的亚细胞定位,从而影响Notch信号途径Numb结合位点。结论表达谱芯片可快速高效锁定与胶质瘤密切相关的基因和寻找肿瘤标志物,LNX新基因与胶质瘤密切相关,通过Notch信号传导途径参与脑胶质瘤发生发展：可成为胶质瘤潜在的治疗靶标。     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

一条全长胰腺癌相关新基因的初步研究

目的 对应用cDNA芯片技术筛选出的一条全长胰腺癌相关新基因进行鉴定.方法 对应用cDNA芯片技术筛选出的一条全长胰腺癌相关新基因进行测序和生物信息学分析,应用RT-PCR和Northern blot检测该基因在12例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织以及4种胰腺癌细胞株中的表达情况.结果 生物信息学分析显示新基因定为于染色体4p15,有一包含501 bp的ORF,拟编码由166个氨基酸组成的蛋白质,其理论分子量为18 293.23,等电点为8.57.BLASTp分析发现,该蛋白与一种人类假想蛋白FLJ90013同源性大于90%,可能为该假想蛋白家族新成员.RT-PCR显示新基因在12例胰腺癌组织和4种胰腺癌细胞株中均表达,而在正常胰腺组织中未见表达.Northern blot分析得到相同的结果.结论 新基因与胰腺癌的发生、发展密切相关,可作为胰腺癌诊断和基因治疗的分子靶标.     

应用抑制消减杂交（SSH）克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异性表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验组。肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照组,应用抑制消减杂交技术,构建实验组特异表达cDNA消减文件;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序序和同源性分析（Genebank）。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDPP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDPP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片断与已知基因有96%～100%的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。     

脑胶质瘤差异表达基因的微矩阵研究

目的 用生物芯片筛选胶质母细胞瘤相关基因。方法 采用一种由包括胶质瘤cDNA文库构建的14 000个基因片段的生物芯片来杂交筛选胶质母细胞瘤的基因并分析其表达谱的变化。结果 经过杂交筛选并与正常脑组织比较,94个基因差异表达超过3倍,298个基因片段超过2倍。一些胶质瘤中上调基因在正常脑组织中几乎没有表达。几个与胶质瘤发生发展相关的新基因被证实。结论 生物芯片结合相关的cDNA文库对大规模快速筛选胶质瘤及其他肿瘤的治疗靶基因具有实际意义。     

Biological function of a novel gene overexpressed in human hepatocellular carcinoma

Objective To clone the full-length of a differentially expressed cDNA fragment, LC27, and study its biological function tentatively. Methods Northern blot was used to analyze the expression pattern of LC27 in hepatocellular carcinoma, matched nontumor liver tissues, fetal liver and normal adult liver tissues, as well as BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line ESTs splicing and 5’ rapid amplification of cDNA ends (5’ RACE) were used to clone the full-length of LC27 cDNA.An antisense oligodeoxynucleotide approach was used to investigate the biological role of the gene in the proliferation of BEL-7402 cells. Results A 2186 bp novel cDNA with an open reading frame encoding a 283 amino acid protein was cloned.Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that it is 38% (88/229) identical to human Golgi 4-transmembrane spanning transporter MTP.The gene and the encoded protein was termed hepatocellular carcinoma overexpressed transmembrane protein (hotp) and HOTP, respectively.Hotp mRNA was almost undetectable in normal adult liver and fetal liver tissues.However, it was significantly up-regulated in hepatocellular carcinoma and some matched nontumor liver tissues, as well as BEL-7402 cells.The proliferation of BEL-7402 cells was suppressed by an antisense oligodeoxynucleotide against hotp mRNA at a concentration of 50 μg/ml. Conclusion HOTP may be an integral membrane transporter protein.The overexpression of the gene in hepatocellular carcinoma may play an important role in hepatocarcinogenesis and disease progression.     

cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...     

Over-expressed genes detected by suppression subtractive hybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE

To screen the over differentially expressed genes in carcinoma induced by BPDE-transformed 16HBE cells （16HBE-C cells）. Methods The suppression subtractive hybridization （SSH） method was performed to profile differentially expressed genes between 16HBE-C cells and 16HBE cells. The cDNA fragments of differentially expressed genes were inserted into TA cloning vector and transformed competent E. coli strain. Positive clones were randomly picked up and identified by the colony PCR method. Dot blot was used to test the same source with the tester. The differentially expressed cDNA fragments were sequenced and compared with known genes and EST database in Genbank. Results Eight known genes were over-expressed in 16HBE-C cells including eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, HIF-1 responsive RTP801, ribosomal protein L10 （RPL10）, ribosomal protein S29 （RPS29）, mitochondrion related genes, and laminin receptor 1. Three differentially expressed cDNA fragments could not be matched to the known genes but to the EST database. Conclusion The SSH method can detect differentially expressed genes between 16HBE-C and 16HBE cells. BPDE-induced carcinogenesis may be related to alteration of at least eight known genes and three unknown genes. These expression data provide a clue to further cloning novel genes and studying functions in BPDE-induced carcinoma.     

应用表达谱芯片研究胶质母细胞瘤相关基因的表达及功能

目的:应用基因表达谱芯片筛选研究人脑胶质母细胞瘤发生,发展中相关基因的表达及生物信息分析功能.方法:采用含13 939条基因(设置173个对照点)的BioStarH140S型表达谱芯片;用改良的"一步法"抽提2例正常脑及6例胶质母细胞瘤组织总RNA,制备杂交探针;杂交芯片后用ScanArray4000扫描芯片荧光信号,提取正常脑及胶质母细胞瘤组织差异基因;对差异基因进行生物信息分析,初步分类及Northern杂交研究.结果:按照差异显著标准,在胶质母细胞瘤中共有198条(1.42%)基因表达差异显著,其中77条(0.55%)表达上调,121条(0.87%)表达下调,55条新基因尚未在GenBank登录;生物信息分析发现肿瘤相关基因与细胞信号和传递蛋白、代谢、蛋白翻译合成、细胞骨架和运动、免疫、原癌基因和抑癌基因、细胞周期、细胞凋亡等9类基因密切相关;Northern杂交结果与表达谱芯片一致.结论:基因表达谱芯片可低成本、高通量、高效率筛选胶质瘤相关基因,并为基因群功能研究提供了方向;本研究结果有助于揭示胶质母细胞瘤分子机制,为指导肿瘤的临床诊断、治疗和预后判断提供依据.     

高密度脂蛋白诱导内皮细胞系差异表达基因的研究

目的：研究高密度脂蛋白（HDL）抗动脉粥样硬化（AS）的分子机理,克隆并分析血管内皮细胞在HDL作用下差异表达的已知和未知基因。方法：应用差异显示逆转录聚合酶链反应技术,分析人脐静脉内皮细胞系（ECV）304经高密度脂蛋白诱导后表达明显差异的cDNA。对差异基因进行序列测定和同源性比较,Northern印迹分析部分差异基因的表达情况。结果：HDL诱导ECV304细胞出现一些上调和下调表达的cDNA,差异表达明显的书籍基因有9个,其中上调表达的基因包括STE20样激酶、PBK1蛋白、转谷氨酰胺酶、肌球蛋白轻链、apobec-1结合蛋白、DAP蛋白;下调表达的基因有核糖体蛋白L7a（RPL7A）、线粒体外膜电压依赖性阴离子通道蛋白基因、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶。差异表达明显的未知基因4个。Northern印迹证实,转谷氨酰胺酶基因表达上调50％,apobec-1结合蛋白基因表达上调70％。结论：HDL可诱导ECV304细胞转谷氨酰胺酶、apobec-1结合蛋白表达水平上调。这两个基因表达水平的升高可能与HDL抗动脉粥样硬化作用相关。     

基因表达谱芯片在筛选胃腺癌相关基因中的应用

目的：应用基因表达谱芯片筛选胃腺癌相关基因,并对这些基因的功能进行初步分析。方法：按一步法抽提胃腺癌和对照胃（正常）组织的RNA并纯化mRNA;将12800条人类基因PCR产物按微矩阵排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片;将等量的对照胃和胃腺癌组织mRNA分别逆转录合成荧光分子掺入的cDNA一链做探针,混合后杂交上述基因芯片。经严格洗片后扫描荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因。结果：在12800条基因中,胃腺癌与正常胃组织间存在差异表达的基因。在所检测的5例临床标本中均存在显差异表达的基因共27条（0．21％）,其中上调的11条（0．086％）,下调的16条（0．125％）,下调的基因中有2条为新基因。结论：微矩阵基因芯片在筛选胃腺癌发生相关基因的改变时、具有快速、高通量、高敏度等特点,胃腺癌基因差异表达谱的分析为胃癌的诊治提供了新的思路和线索。     

Cloning of human brevican cDNA and expression of its mRNA in human glioma

Objective: To clone the cDNA of human brevican secreting isoform and to investigate its mRNA expression in human glioma. Methods:The full-length cDNA of human brevican secreted isoform was cloned from a human anaplastic astrocytoma by RT-PCR, and the expression of human brevican mRNA in 22 cases of human glioma and 13 cases of non-glial brain tumors were investigated by in situ hybridization. Results:The cDNA which including the whole open reading frame of human brevican secreted isoform was obtained. In situ hybridization showed that brevican positive cells were present in all of the 22 cases of gliomas (100%), whereas none were found in the 13 cases of non-glial and metastasis brain tumors examined. Conclusion: The results suggest that brevican mRNA is highly and specifically expressed in human glioma.     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的 :从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中 ,初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法 :随机挑选 48个片段作反Northern印迹杂交分析 ,将杂交信号有差别的 15个片段送测序公司进行测序 ,用Gen BankBlast程序检索 ,以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因 ,观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果 :所获得的 7个序列中 :3y5 9与已知基因同源性很小 ,且 3y5 9在 30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中 ,19例 (6 3.3 % )表达有差别 ,11例 (36 .7% )表达无差别 (P <0 .0 5 )。 3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外 5个片段 3y2 0 ,3y14,3y90 ,3y91和 3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingprotein ,Keratin6 (KRT6C)和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论 :3y5 9可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现 ,geminin基因 ,核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingpro tein ,Keratin6 (KRT6C) ,内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

大鼠肝再生中1个表达上调新基因的克隆表达及分析

目的　克隆肝再生相关新基因。方法　以抑制性消减杂交得到的1个EST为模板制备探针,运用Southern印迹方法,从构建的再生肝76 h c DNA文库中调取了它的c DNA全长,并利用基因原核表达技术,表达并纯化出它的蛋白产物,制作了该蛋白的兔源多抗,分别用所制该基因的探针,采用点杂交技术检测了0～76 h的再生肝材料。结果　获得了1个新基因全长,BL AST检索结果为1未知功能基因,暂时命名为liver regeneration relatedprotein(L RRP) ,大鼠基因组数据库中检索结果证实L RRP位于19q12且由4个外显子和3个内含子组成,递交Gen Bank获登录号为AY0 98917。表达纯化出了它的融合蛋白产物,并得到了它的多克隆抗体。点杂交结果也证实了基因在肝切除后76 h明显上调。结论　L RRP基因全长的克隆和它的高效多克隆抗体的获得为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

基因芯片技术筛选2型糖尿病胰岛素抵抗脂肪代谢相关差异表达基因

目的:应用基因芯片技术比较2型糖尿病胰岛素抵抗(IR)患者和正常人大网膜组织脂肪代谢相关基因表达谱的差异,探讨IR可能的发病机制.方法:分别用Cy5 和Cy3两种不同的荧光染料通过逆转录反应将IR组(n＝5)和正常对照组(n＝5)脂肪组织的mRNA标记成探针,并与载有一组靶基因的基因表达谱芯片进行杂交,通过扫描荧光强度,计算机软件分析,寻找两组差异表达基因.然后对芯片筛选结果中差异表达的FOXC2基因用Northern印迹法进行验证.结果:IR组和正常对照组之间共筛选出82条差异表达已知基因;其中脂肪代谢相关基因10条,表达增加的基因5条,表达降低的基因5条.Northern印迹证实IR组FOXC2 mRNA表达明显升高,与基因芯片检测结果一致. 结论:IR的发病与脂肪代谢相关,FOXC2可能是2型糖尿病IR的候选基因.