低强度脉冲式超声波在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分化中的抗炎和抗氧化作用

目的研究低强度脉冲式超声波（LIPUS）对RAW264.7巨噬细胞极化的影响及相关分子机制。 方法100 ng/mL脂多糖（LPS）和10 ng/mL白细胞介素（IL）-4诱导巨噬细胞RAW264.7分别向M1和M2型极化，45 mW/cm²强度LIPUS对巨噬细胞处理25 min。采用流式细胞术检测巨噬细胞氧化应激活性氧（ROS）水平、M1分化标志物CD80和CD11b，以及M2分化标志物CD163的表达水平。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测CD80、CD11b、核转录因子κB（NF-κB）p65、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的mRNA水平。采用Western blot技术检测细胞p65、p-p65、TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。采用流式细胞术检测细胞培养上清TNF和IL-6表达水平。 结果LIPUS可明显减少LPS诱导的RAW264.7细胞ROS水平。LPS诱导后，RAW264.7细胞M1分化标志物CD80和CD11b表达和转录水平均上调；LIPUS可抑制LPS对RAW264.7细胞向M1的诱导，差异具有统计学意义。并且，LIPUS可促进IL-4诱导的巨噬细胞M2分化标志物CD163表达。LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平上调，LIPUS可下调这些炎症因子的mRNA水平，差异均具有统计学意义。LIPUS抑制了LPS对RAW264.7细胞因子蛋白p65和p-p65、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达上调的作用。胰酶可以通过激活ROS-NF-κB通路，回复LIPUS促进巨噬细胞M1分化的作用。 结论LIPUS可通过ROS-NF-κB抑制RAW264.7向巨噬细胞M1型分化，促进RAW264.7向巨噬细胞M2型分化。氧化应激和炎症因子表达水平被抑制。LIPUS可能在牙周疾病中起到抑制氧化和炎症的作用，从而发挥对牙周疾病的治疗功能。     

重组人β防御素3对牙龈卟啉单胞菌脂多糖致炎作用的影响

目的:以牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.g-LPS)诱发载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠和RAW264.7小鼠单核巨噬细胞的急性炎症反应,并应用重组人β防御素3(rhBD3),观察其对炎症的干预效果。方法:20周龄雄性ApoE-/-小鼠随机均分为PBS对照组、P.g-LPS组和P.g-LPS+rhBD3组,分别经腹腔注射给药2h后,检测血清中不同炎症指标(MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1β和NO)的水平。同时,以rhBD3干预P.g-LPS对RAW264.7细胞的致炎作用,分别检测培养上清和细胞中炎症指标的水平及其mRNA的相对表达量。结果:经P.g-LPS刺激后,ApoE-/-小鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6和NO的水平较对照组显著上调;而同时应用rhBD3能明显降低MCP-1、TNF-α和NO表达量。P.g-LPS能显著上调RAW264.7细胞培养上清中TNF-α和NO的水平以及细胞中TNF-α和IL-6的mRNA相对表达量,rhBD3对此具有抑制作用。结论:rhBD3对P.g-LPS在体内、外诱导的急性炎症具有一定的抑制效应,可能在牙周炎与高脂血症的相互作用中发挥免疫调节作用。     

氧化石墨烯修饰的类骨单位钛表面对巨噬细胞破骨分化影响的研究

目的 本研究通过模拟天然骨单位进行同心圆结构的设计,并修饰氧化石墨烯（GO）,探究新的仿生微纳米结构表面对巨噬细胞RAW264.7破骨分化的影响。方法 实验分为光滑钛片组（SS）、微沟槽组（CMS）和微沟槽表面修饰GO组（GO-CMS）,利用扫描电子显微镜（SEM）、接触角测量仪、原子力显微镜、X射线光电子能谱分析仪和拉曼光谱仪研究材料表面的理化性能,通过细胞活性检测、SEM和激光共聚焦显微镜研究修饰后的材料表面对RAW264.7的细胞生物学行为的影响,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）免疫荧光染色、TRAP定量检测和荧光实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）研究其对巨噬细胞破骨分化的影响。结果 巨噬细胞沿着微沟槽排列成同心圆状,修饰GO后,材料表面含氧基团增多,亲水性增加。GO-CMS组诱导形成的破骨细胞体积小,数量少,TRAP表达量最少,TRAP单位酶活性也最低。GO-CMS组虽然促进巨噬细胞的增殖,但破骨分化相关基因的表达低于SS组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 同心圆微沟槽限制了破骨细胞的融合及封闭区的形成,GO修饰类骨单位同心圆微沟槽抑制了巨噬细胞RAW26...     

脂多糖刺激的单核巨噬细胞培养上清液对小鼠MC3T3-E1细胞c-fos表达的影响

目的：研究经牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）脂多糖（LPS）刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞（MC3T3-E1细胞）c-fos表达的影响。方法：收集100μg/L的Pg LPS刺激RAW264.724h后的上清液,以20%稀释浓度分别作用于MC3T3-E1,分别在1、3、6、12、24、48、72h时,采用RT-PCR和Western blot检测ALP mRNA、c-fos mRNA及蛋白表达水平的变化。结果：Pg LPS刺激RAW264.7细胞培养上清作用于MC3T3-E1后,ALP mRNA表达均下降,在6h时表达最低,而c-fos的mRNA和蛋白水平均提高,分别在3h和6h时达最高水平。结论：Pg LPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清可通过上调成骨细胞c-fos的表达而抑制其成骨能力。     

压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响

目的 探讨压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12（DAP12）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）表达的影响。方法 以小鼠单核细胞RAW264.7为研究对象,采用四点弯曲体外细胞加载装置加载压应力0、3、6、12 h,分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法检测DAP12、TRAP mRNA和DAP12蛋白的表达情况。结果 小鼠单核细胞RAW264.7经破骨细胞培养液培养后,体积变大,核数目增多,TRAP染色阳性。受压应力刺激后,DAP12、TRAP mRNA及DAP12蛋白表达随加力时间延长而增加（P<0.05）。结论 小鼠单核细胞RAW264.7经破骨细胞培养液培养后成功向破骨细胞转化,转化细胞受压应力刺激活化过程中存在DAP12高表达。     

负载地塞米松DNA水凝胶改善镁周围成骨微环境研究

目的 研究负载地塞米松（dexamethasone,Dex）DNA水凝胶对镁周围成骨微环境的影响。方法 研究于2019年5月至2021年5月在军事口腔医学国家重点实验室进行。将108个阳极氧化处理后的镁片按照不同表面处理方式随机分为3组,每组36个,分别记为空白对照组（未涂布任何物质）、水凝胶组（涂布DNA水凝胶）、Dex水凝胶组（涂布负载Dex的DNA水凝胶）。扫描电镜观察每组试样表面结构,同时检测培养液浸泡试样后pH值的变化及镁离子累积释放浓度;将小鼠巨噬细胞RAW264.7与试样间接共培养,应用CCK-8法测定细胞活力;应用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞极化相关基因精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达,再利用流式细胞术检测极化标志物CD206和趋化因子受体7(chemokine receptor 7...     

OLP中TNF-α、TGF-β1及其受体与细胞凋亡的关系和临床意义

目的 研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其受体TNFR1，转化生长因子-β1（TGF-β1）及其受体TGFβR1在口腔扁平苔藓（OLP）的定位表达，以及与细胞凋亡的关系。方法 采用免疫组化法定位检测OLP组织和正常口腔粘膜（NOM）TNF-α、TNFR1、TGF-β、TGFβR1的蛋白表达；应用原位缺口末端标记技术，检测OLP、NOM组织细胞凋亡情况。结果 TNF-α、TNFR1在OLP组织（上皮层和固有层）内表达均有增强，明显高于对照组，二者在OLP上皮内可分布于上皮细胞，TNF-α多见于巨噬细胞和淋巴细胞，TNFR1则主要分布于部分巨噬细胞。TGF-β1在OLP固有层以及TGFβR1在上皮层和固有层的表达均有增强。TGFβR1可见于OLP全层上皮细胞，在固有层，TGF-α、TGFβR1则主要分布于成纤维细胞、血管内皮细胞和部分巨噬细胞内，二者在淋巴细胞内少见。细胞凋亡在OLP上皮层高于正常。上皮层中其阳性细胞集中分布于下部或全层上皮细胞。上皮层TNF-α表达与凋亡指数呈高度正相关。结论 TNF-α、TNFR1可能是促使上皮细胞凋亡的因素之一。TNFR1、TGF-β1、TGFβR1在OLP淋巴细胞内表达缺失，可能导致OLP痛程慢性迁延。     

钛表面纳米形貌介导的巨噬细胞极化对骨髓间充质干细胞的影响

目的 ：探究钛表面纳米形貌介导的巨噬细胞极化对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的影响。方法：选用机械加工的纯钛片作为对照组（control-Ti组）;将180℃下水热反应12 h后的纯钛片作为纳米组（nm-Ti组）。通过扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）和水接触角测试其表面性能,细胞学实验检测其生物相容性,实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测RAW264.7巨噬细胞极化的相关基因和BMSCs成骨相关基因的表达,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测巨噬细胞炎症相关因子的分泌水平。结果：经过水热处理后,钛片表面形成纳米形貌,且具有良好的亲水性。相比于control-Ti组,nm-Ti组表面细胞增殖和黏附更为活跃。ELISA结果显示,随时间增加,nm-Ti组分泌白细胞介素-10(interleukin-10,I...     

高分子三维支架材料通过诱导外周巨噬细胞的极化促进成骨前体细胞分化

目的:考察硫酸软骨素-壳聚糖-羟基磷灰石(SF-CS-HA)三维支架材料对小鼠巨噬细胞极化的影响,并进一步研究骨免疫微环境调控对小鼠颅顶骨前体细胞在骨皮质外骨生成的影响。方法:制备SF-CS-HA三维支架材料,将支架材料与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养,流式细胞术检测巨噬细胞的M2型分化情况,RT-qPCR检测炎症因子基因的表达,Western blot检测TGF-β蛋白表达的变化。将巨噬细胞与SF-CS-HA三维支架材料共孵育后,制备条件培养基,比较完全培养基和条件培养基对小鼠颅顶骨前体细胞MC3T3-E1(3T3)增殖、迁移、ALP活性及形态变化,并通过Western blot检测骨生成相关蛋白的表达。最后,通过动物模型验证SF-CS-HA材料对于小鼠颅骨骨量增加的影响。结果:扫描电镜观察显示,SF-CS-HA三维支架材料表面和内部都具有均匀的空腔结构。流式细胞术检测结果显示,SF-CS-HA三维支架材料能够促进小鼠外周巨噬细胞向M2型极化。RT-qPCR和Western blot结果显示,SF-CS-HA三维支架材料提高了IL-10基因和TGF-β蛋白的表达量,降低了IL-1...     

促红细胞生成素对破骨细胞调控机理的研究

目的研究小鼠单核巨噬细胞在体外向破骨细胞分化的过程中,促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）与破骨细胞表面受体Epor结合发挥作用的机理。方法 EPO作用于Epor受体沉默的经诱导的小鼠单核巨噬细胞,观察TRAP阳性多核细胞数目变化。Real-time PCR检测RAW264.7向破骨细胞分化过程中相关基因Epor、Nfatc1、Mmp9、EphrinB2基因的表达。结果与对照组比较,4天后,Epor沉默组的Nfatc1、EphrinB2 mRNA的表达明显升高（P〈0.01）,Ctsk Mmp9 mRNA的表达明显降低（P〈0.01）。结论 EPO通过与破骨细胞表面受体Epor结合,引发破骨细胞内相关基因表达改变,进而影响破骨细胞的分化和活化。     

DHA对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导巨噬细胞炎症的抑制作用

目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)对牙龈卟啉单胞菌(P.g)脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症的抑制作用.方法 用CCK-8方法检测DHA对P.g-LPS诱导的小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞的毒性.将P.g-LPS与RAW264.7细胞共培养24 h后,更换含有DHA的培养基培养24 h,实时荧光逆转录定量PC...     

Effect of iRoot SP and mineral trioxide aggregate (MTA) on the viability and polarization of macrophages

ObjectiveThis study was performed to investigate the effect of iRoot SP and mineral trioxide aggregate (MTA) on the viability and polarization of macrophages.MethodsThe effect of iRoot SP and MTA on the viability of RAW 264.7 macrophages was tested using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay after 1 and 2 days of culture. The gene expression levels of interleukin 1β (IL-1β), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 10 (IL-10), interleukin 12p40 (IL-12p40) were measured by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) after stimulation of the RAW 264.7 macrophages with iRoot SP and MTA. The expression levels of CD11c and CD206 in RAW 264.7 macrophages were examined by immunofluorescence and flow cytometry after stimulation with iRoot SP and MTA. The data were analyzed by one-way analysis of variance and the Tukey test.ResultsBoth iRoot SP and MTA were non-toxic to the RAW 264.7 macrophages. The use of iRoot SP and MTA increased the expression of IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-12p40 on the first day of culture and could promote macrophage M1 and M2 polarization.ConclusionsMTA and iRoot SP have good biocompatibility with macrophages, and they induced both M1 and M2 polarization of the RAW 264.7 macrophages.     

TGF-β1对钛表面成骨相关蛋白基因表达的影响

目的:通过观测特定浓度的转化生长因子β1(transforming growth factorsβ1,TGF-β1)对钛表面成骨细胞中骨钙素(osteocalcin,OC)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和I型胶原蛋白(collagen-I,COL-I)基因表达的影响,以探讨其对钛表面成骨细胞分化的作用。方法:体外培养成骨细胞接种于钛片表面,将其分为实验组和对照组,实验组加入0.5ng/ml的TGF-β1刺激细胞增殖和分化,收集第1d、3d、7d培养的细胞。通过RT-PCR检测不同培养时间OCmRNA、BSPmRNA和Col-ImRNA表达情况,对照组不加TGF-β1。结果:浓度为0.5ng/ml的外源性TGF-β1加入到接种于钛片表面的成骨细胞中后,均可显著增加几种细胞因子(OC、BSP和Col-I)基因的表达(P<0.05)。结论:浓度为0.5ng/ml的外源性TGF-β1对钛片表面的成骨细胞成骨相关因子表达有一定的促进作用。     

他米巴罗汀对牙龈卟啉单胞菌抗原刺激RAW264.7细胞的影响

目的 探讨他米巴罗汀（Tamibarotene,Am80）对经牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）抗原刺激后的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的影响。方法 采用P.gingivalis抗原刺激RAW264.7细胞,分别用不同浓度的Am80进行干预;相差显微镜下观察各组细胞生长情况;MTS法检测不同浓度Am80对抗原刺激RAW264.7细胞的增殖情况;酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清中抗炎因子IL-10的含量。结果 10 nmol/L Am80能够显著抑制P.gingivalis抗原刺激RAW264.7细胞的增殖分化（P<0.001）;Am80（10 nmol/L）致抗原刺激的细胞IL-10的分泌量显著增加（P<0.05）;倒置相差显微镜下观察显示Am80抑制抗原刺激细胞的增殖分化。结论 Am80（10 nmol/L）时可显著促进P.gingivalis抗原诱导小鼠巨噬细胞分泌抗炎因子IL-10,并可能由此抑制P.gingivalis抗原诱导的炎症反应。     

紫外线照射对两种钛种植体表面形貌体外炎症反应的影响

目的:紫外线照射的抛光试件和TiO2纳米管试件对巨噬细胞增殖和细胞因子分泌的影响.方法:抛光组和纳米管组试件避光保存后,各取一半经紫外线照射获得抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组试件.测量各组试件表面接触角;在各组试件上培养RAW264.7巨噬细胞,另设空白对照组.检测培养4、24和72h时巨噬细胞黏附和增殖情况;液相芯...     

脱蛋白牛骨基质对骨膜细胞影响巨噬细胞M1表型的调控

目的:探讨脱蛋白牛骨基质骨替代材料与炎症环境中骨膜细胞的条件培养液对巨噬细胞M1表型的影响。方法:取P3代小鼠颅骨骨膜细胞,10 ng/mL LPS刺激24 h,分别换成常规培养基和脱蛋白牛骨基质(Bio-Oss骨粉)浸提液培养24 h,取上清记为A液、B液。体外培养小鼠RAW264.7细胞,100 ng/mL LPS诱导成为M1型巨噬细胞,分别加入条件培养液A液(对照组)和B液(实验组)。培养24 h后CCK-8检测细胞增殖活性;qRT-PCR分析M1型表型基因诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)。免疫荧光检测iNOS的表达。结果:CCK-8结果显示,实验组M1巨噬细胞增殖活性提高。与对照组相比,实验组iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达均下调(P<0.05);免疫荧光结果显示,实验组的iNOS表达下调。结论:脱蛋白牛骨基质可抑制骨膜细胞间接作用下的巨噬细胞M1表型基因的表达。     

三七总皂苷对兔BMSCs的成骨分化及TGF-β1表达的影响

目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化及TGF-β1在基因水平表达变化的影响。方法:体外分离培养兔BMSCs,观察不同浓度PNS(50、100、200 mg/L)对兔BMSCs的影响,采用MTT法检测细胞增殖,茜素红染色观察钙结节形成,qRT-PCR检测TGF-β1表达水平。结果:各浓度PNS培养下的细胞增殖无明显差异(P>0.05);100、200 mg/L PNS组的钙结节数量和TGF-β1的表达水平均高于阴性组(P<0.05)。结论:PNS可促进兔BMSCs的成骨分化并刺激其分泌TGF-β1,但无明显促细胞增殖作用。     

Zeste基因增强子人类同源物2抑制剂GSK343调节巨噬细胞分化的作用

目的 研究Zeste基因增强子人类同源物2（EZH2）抑制剂GSK343调节巨噬细胞亚群的分化,探讨EZH2在牙周炎中潜在的治疗作用。方法 将巨噬细胞RAW264.7分为4组：空白组（A组）、对照组（B组）、内毒素（LPS）刺激组（C组）、LPS+GSK343组（D组）。细胞经培养及相应处理后,利用免疫印迹和酶联免疫吸附试验检测其表型生物学标志变化,包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素-10（IL-10）和精氨酸酶-1（Arg-1）。利用大肠杆菌吞噬试验检测巨噬细胞RAW264.7在不同条件下对大肠杆菌的吞噬作用。结果 LPS可以诱导RAW264.7产生M1表型生物标志（TNF-α和iNOS表达增加）,在加入EZH2抑制GSK343后,IL-10和Arg-1表达升高,提示EZH2抑制剂GSK343可以诱导RAW264.7细胞由M1型向M2型转化;RAW264.7细胞具有吞噬大肠杆菌的作用,加入LPS的条件下吞噬大肠杆菌作用加强,而EZH2抑制剂GSK343可以调节RAW264.7细胞对大肠杆菌的吞噬作用。结论 EZH2抑制剂GSK343可以调节巨噬细胞的分化,在牙周炎的治疗中可能具有潜在作用。