模拟微重力对人牙髓干细胞在PLGA支架上黏附影响的研究

采用酶消化法培养hDPSCs,并进行鉴定。将hDPSCs在模拟微重力条件接种于PLGA支架,接种细胞数分别为0.2×106、0.4×106、0.8×106、1.2×106个/支架,以常规条件接种作为对照组。接种24h后通过细胞计数检测细胞粘附率;扫描电镜(SEM)观察细胞形态。结果:模拟微重力条件接种组随接种细胞数的增多,黏附率显著升高(P<0.01),常规条件接种组黏附率略有降低(P<0.05);当接种细胞数为0.4×106、0.8×106、1.2×106/支架时,实验组高于对照     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体内增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上人牙髓干细胞（hDPSCs）体内增殖能力的影响。方法：分离、培养hDPSCs并进行鉴定。以PLGA作为支架材料培养人牙髓干细胞,将hDPSCs-PLGA复合物分别在模拟微重力环境和普通重力环境下培养72h,然后移植到裸鼠背部皮下。植入4周后取出组织块,分别进行HE染色、Masson染色、Ki67和I型胶原免疫组化检测。结果：模拟微重力环境下细胞密度、胶原生成量、I型胶原表达量和Ki67阳性细胞数量明显高于普通环境（P〈0.01）。结论：模拟微重力环境培养的hDPSCs的体内增殖能力高于普通重力组。     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体外增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）在PLGA支架上体外增殖能力的影响。方法：将分离、鉴定后的人牙髓干细胞接种在PLGA支架上,采用MTT法检测普通环境和模拟微重力环境中培养24、48、72h的人牙髓干细胞在PLGA支架上的细胞活性。DAPI荧光染色和流式细胞术比较牙髓干细胞在两种环境培养3d的细胞数量以及细胞周期分布情况。结果：MTT显示模拟微重力组中各时间点的A值均高于普通环境培养组;DAPI荧光染色显示在模拟微重力下培养3d的人牙髓干细胞数量明显多于普通环境培养组;细胞周期分析结果表明模拟微重力组中S期细胞比例明显高于普通环境培养组（P〈0.05）。结论：接种在PLGA支架上的人牙髓干细胞在模拟微重力环境下较普通环境具有更高的体外增殖能力。     

模拟微重力对人牙髓干细胞-PLGA复合物矿化的影响

目的:研究模拟微重力(SMG)对人牙髓干细胞(hDPSCs)在聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上矿化的影响。方法:采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,并进行鉴定。hDPSCs常规接种于PLGA支架,24h后,模拟微重力环境和普通环境下分别矿化诱导。矿化诱导第3、5、7、10、14天时进行碱性磷酸酶活性检测,第21天时进行茜素红染色以观察人牙髓干细胞在PLGA支架上矿化结节形成情况。结果:模拟微重力环境下的碱性磷酸酶活性明显低于普通环境(P<0.01),茜素红染色显示模拟微重力环境下形成的矿化结节较普通环境下的小且数量少。结论:模拟微重力环境抑制hDPSCs在PLGA支架上的矿化。     

模拟微重力对人牙髓干细胞在裸鼠体内矿化能力的影响

目的:研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在裸鼠体内矿化能力的影响。方法:分离、培养hDPSCs并进行鉴定,然后将hDPSCs接种到PLGA支架上培养72 h后随机分为两组,普通重力组和模拟微重力组,经矿化诱导液培养1周后分别将细胞支架复合物移植到裸鼠体内,植入术后4周取材,进行组织学(HE和Vonkossa)和免疫组织化学(DSPP)检测。结果:HE染色均可见有血管生成,Vonkossa染色均为阳性,模拟微重力组DSPP的表达水平明显高于普通重力组(P<0.05)。结论:模拟微重力有利于hDPSCs在裸鼠体内的矿化。     

整合素α6对模拟微重力下人牙髓干细胞粘附能力的影响

目的:探究整合素α6对模拟微重力下人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)粘附能力的影响。方法:以PLGA支架为载体,将采用酶消化法培养的hDPSCs接种在PLGA支架上,分普通重力组和模拟微重力组培养72 h,Western blot检测整合素α6(Integrin α6)、整合素αv(Integrin αv)、整合素β1(Integrin β1)、粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、磷酸化粘着斑激酶(phospho-FAK)的达;si-RNA转染hDPSCs,抑制整合素α6表达,DAPI荧光染色检测转染后hDPSCs在PLGA支架上的粘附数量,Western blot检测转染后hDPSCs中整合素β1、FAK、phospho-FAK的表达。结果:模拟微重力下, 整合素α6、phospho-FAK蛋白水平上调(P＜0.05),整合素αv、整合素β1和FAK的蛋白水平未见显著性差异;si-RNA转染的hDPSCs粘附能力、phospho-FAK蛋白水平均低于对照组(P＜0.05),整合素β1和FAK的蛋白水平未见显著性差异。结论:模拟微重力下,hDPSCs在PLGA支架上粘附能力增强可能与整合素α6及其下游信号分子FAK的表达水平上调相关。     

模拟微重力对人牙髓干细胞细胞骨架及迁移能力影响的研究

目的:初步研究模拟微重力(simulated microgravity,SMG)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)细胞骨架及迁移能力影响的信号通路机制。方法:采用酶消化法分离培养hDPSCs,并将其接种于PLGA支架上进行模拟微重力培养及普通重力培养。72 h后收集细胞,行Realtime-PCR检测LARG(leukemia-associated Rho GEF factor)基因的mRNA相对定量表达;拖拽实验检测RhoA-GTP表达情况;western blot检测RhoA及下游信号分子LIMK-P蛋白表达情况。结果:模拟微重力下培养的hDPSCs细胞LARG基因的mRNA表达下调(P<0.05);微重力下RhoA-GTP、RhoA及LIMK-P蛋白表达均较对照组下调(P<0.05)。结论:模拟微重力下人牙髓干细胞细胞骨架的重排,细胞迁移能力的改变可能与RhoA/ROCK信号通路有关。     

人牙髓干细胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附与增殖的研究

目的：研究成人牙髓干细胞（HDPSCs）在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）支架上粘附与增殖的情况。方法：采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,免疫组化法及体外诱导分化对细胞进行鉴定。将人牙髓干细胞与PLGA支架材料进行复合培养,扫描电镜（SEM）观察支架材料形态,细胞粘附、增殖及基质分泌情况;细胞计数检测其增殖力。结果：细胞接种2、5、10d,扫描电镜及细胞计数均显示HDPSCs与PLGA支架材料粘附紧密,生长状态良好,细胞明显增殖（P〈0.05）,有丰富的细胞外基质形成。结论：PLGA是一种适宜人牙髓干细胞粘附与增殖的支架材料。     

不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合支架对人牙髓干细胞增殖及矿化能力影响研究

目的　探讨不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石（PLGA/HA）复合支架的降解速率及其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法    采用溶液浇筑/颗粒沥析技术构建含质量分数分别为10%、20%及30% HA的PLGA/HA复合支架的3个实验组,单纯PLGA支架作为对照组。采用降解实验检测支架的降解速率。将hDPSCs接种于不同比例的PLGA/HA复合支架进行培养,扫描电镜观察细胞形态,应用MTT法检测细胞增殖能力。hDPSCs接种于各组支架培养72 h后,将复合支架植入裸鼠体内,分别于饲养1个月及3个月后处死裸鼠取出支架,应用HE染色观察组织学形态,应用牙本质基质蛋白1（DMP1）免疫组化染色观察细胞的矿化程度。结果    10%HA组和20%HA组具有较适宜的降解速率。各组均具有较高的促hDPSCs增殖能力,促进效果随HA含量的增加而加强。HE染色和免疫组化染色结果显示,HA可促进hDPSCs在体内的成牙本质向分化,分化程度与HA含量成正比,20% HA组及30% HA组矿化程度均较佳。结论   含20%HA的PLGA/HA复合支架具有较佳的降解速率及促细胞增殖和矿化能力,是比较理想的细胞支架材料。     

不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合支架对人牙髓干细胞增殖及矿化能力影响研究

 目的　探讨不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石（PLGA/HA）复合支架的降解速率及其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法    采用溶液浇筑/颗粒沥析技术构建含质量分数分别为10%、20%及30% HA的PLGA/HA复合支架的3个实验组，单纯PLGA支架作为对照组。采用降解实验检测支架的降解速率。将hDPSCs接种于不同比例的PLGA/HA复合支架进行培养，扫描电镜观察细胞形态，应用MTT法检测细胞增殖能力。hDPSCs接种于各组支架培养72 h后，将复合支架植入裸鼠体内，分别于饲养1个月及3个月后处死裸鼠取出支架，应用HE染色观察组织学形态，应用牙本质基质蛋白1（DMP1）免疫组化染色观察细胞的矿化程度。结果    10%HA组和20%HA组具有较适宜的降解速率。各组均具有较高的促hDPSCs增殖能力，促进效果随HA含量的增加而加强。HE染色和免疫组化染色结果显示，HA可促进hDPSCs在体内的成牙本质向分化，分化程度与HA含量成正比，20% HA组及30% HA组矿化程度均较佳。结论   含20%HA的PLGA/HA复合支架具有较佳的降解速率及促细胞增殖和矿化能力，是比较理想的细胞支架材料。     

模拟微重力条件HN13细胞的生长特点

目的:观察口腔鳞状细胞癌细胞HN13在模拟微重力条件下的形态学特点和生长情况,检测肿瘤细胞分化和侵袭相关基因的表达,并分析其生物学意义。方法:将HN13细胞接种于聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolicacid,PLGA),应用旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)进行模拟微重力培养14d,光学倒置显微镜下观察细胞的形态,以实时定量PCR检测分析立体培养和平面培养细胞中,HIF1α、TGFβ1、VEGF-C、NF-κB和CCND1等基因的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:细胞贴附于PLGA材料表面呈立体生长,表现为典型角化细胞形态,并形成类角化珠样结构,与口腔鳞状细胞癌细胞形态相似。HIF1α,TGFβ1和NF-κB表达降低(P<0.05),VEGF-C表达升高(P<0.05),CCND1表达无显著改变(P>0.05)。结论:模拟微重力条件下三维培养的细胞更接近体内细胞的真实形态,模拟微重力可作为构建体外细胞三维培养模型的方法。     

模拟微重力影响人牙髓干细胞的矿化能力与RhoA-Rho激酶信号通路相关性研究

目的初步研究Rho A-Rho激酶信号通路在模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)矿化过程中的作用。方法将经酶消化法分离、纯化后的人牙髓干细胞体外扩增培养,以1×106细胞接种于PLGA支架上,分别于模拟微重力下及普通重力下矿化诱导液中培养,72 h后收集细胞,采用Western Blot检测Rho A蛋白表达;此外,在重力条件下采用Rho激酶抑制剂Y-27632,以矿化诱导液培养组作为对照组,检测矿化诱导3、5、7、10d两组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性变化,采用Western Blot检测矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达,采用茜素红染色法检测矿化诱导21 d,矿化结节形成水平。结果模拟微重力下,人牙髓干细胞中Rho A蛋白的表达下调;在普通重力矿化诱导条件下,加入抑制剂Y-27632后,各时间点细胞AKP表达水平均较对照组有所降低;矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白DSP、DSPP、DMP-1表达明显下调,矿化诱导21 d,矿化结节形成同样有所减少。结论模拟微重力下,Rho A蛋白表达水平下调;抑制Rho激酶的表达,可降低h DPSCs矿化能力,提示Rho A-Rho激酶信号通路可能参与模拟微重力对h DPSCs矿化能力的影响。     

PRP对纳米HA/PLGA复合支架上鼠骨骼肌卫星细胞增殖和成骨活性的影响

目的:研究富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)/聚乳酸乙醇酸(poly lactic acid-co-glycolic acid,PLGA)(nHA/PLGA)支架上SD大鼠骨骼肌卫星细胞(muscle satellite cells,MSCs)黏附、增殖和成骨活性的影响。方法:将体外培养、扩增的鼠MSCs与同一供体来源的PRP混合,滴加到nHA/PLGA支架上,形成MSCs/PRP/nHA/PLGA复合物(实验组),继续在体外培养,以MSCs/nHA/PLGA复合物作为对照组。通过扫描电镜观察MSCs在支架上黏附、生长和增殖情况;水溶性四氮唑法(WST-1)法测定MSCs增殖情况;碘化丙啶(PI)与钙黄绿素-AM(Calcein-AM)检测MSCs的荧光活性;组织化学方法检测培养液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和骨钙素(osteocalcin,OC)含量;RT-PCR检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA的表达。结果:扫描电镜观察显示,实验组大量MSCs黏附在支架表面及其洞壁上,并大量增殖和分泌骨基质,而对照组复合材料表面细胞附着较少;WST-1测定实验组吸光度值明显大于对照组(P<0.05);PI荧光染色二组的死细胞数量均较少;实验组ALP活性和OC含量均较对照组增高明显(P<0.05);RT-PCR结果显示OPN在实验组中表达明显增强。结论:PRP促进了nHA/PLGA支架上鼠MSCs黏附、增殖和成骨分化。