富血小板血浆对人真皮细胞增殖及PDGF、TGF-β和VEGF表达的影响

目的:研究富血小板血浆(PRP)对人真皮成纤维细胞(hFbs)增殖、分化及胞质中PDGF、TGF-β和VEGF表达量的影响。方法:2次离心法制备PRP,成骨诱导条件下hFbs培养液中加入不同浓度PRP于第12天、21天钙-钴法染色,第21天茜素红染色;免疫细胞化学法检测加不同浓度PRP后第4天细胞PDGF、TGF-β和VEGF的表达;碱性磷酸酶染色(ALP)检测细胞活性;CCK-8法检测有和无成骨诱导条件下不同浓度PRP对细胞增殖的影响。结果:茜素红染色显示,2.8%PRP组钙结节形成最明显;钙-钴法染色显示,2.8%PRP组矿化作用最强;免疫细胞化学结果表明PDGF表达存在剂量依赖性,TGF-β和VEGF表达虽无剂量依赖性,但有适宜浓度的要求;ALP染色表明3%PRP组细胞增殖明显,活性最强。CCK-8检测表明各浓度PRP对hFbs均有促增殖作用,PRP加成骨诱导组比单纯PRP组表现出更明显的促增殖作用,其中4.8%PRP促增殖作用最强。结论:适宜浓度的PRP可促进hFbs增殖,但相关因子的表达存在适宜浓度的要求,PRP通过促进细胞增殖,增加相关因子表达促进创伤愈合。     

黄精多糖对乳牙牙髓干细胞增殖及成骨向分化的影响

目的:初步探索不同浓度黄精多糖(PSP)对乳牙牙髓干细胞(SHEDs)增殖及成骨分化能力的影响.方法:分离、培养SHEDs,通过流式细胞术及茜素红染色分别对细胞表面标志物和成骨分化潜能进行鉴定.采用不同浓度PSP处理SHEDs后,CCK-8法检测SHEDs的增殖情况,钙钴法染色和碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测其ALP活...     

富血小板血浆对鼠骨骼肌卫星细胞增殖及成骨活性的影响

目的:观察富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对体外培养的SD大鼠骨骼肌卫星细胞(muscle satellitecells,MSCs)增殖与诱导成骨的影响,探讨富血小板血浆诱导MSCs成骨的可能机制。方法:从SD大鼠心脏抽取全血,参照Landesberg法制备PRP,并进行全血和PRP中血小板(PLT)计数。取新生3～5 d的SD大鼠四肢骨骼肌,采用酶消化及差速贴壁法体外培养鼠MSCs,采用免疫组织化学的方法进行鉴定。四甲基偶氮唑盐法(MTT)观察不同浓度的自体PRP(1.6%、6.25%、12.5%)对MSCs增殖的影响;以碱性磷酸酶(ALP)钙钻法染色、ALP活性测定、茜素红染色及骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色法,检测PRP对MSCs向成骨细胞分化的诱导作用。结果:采用Landesberg法成功获取PRP;酶消化及差速贴壁的方法成功获取MSCs,desmin及α-sarcomeric actin免疫组织化学染色阳性;浓度为6.25%的PRP可明显促进MSCs的增殖;ALP钙钴法染色阳性,胞质内见大量黑色颗粒沉积;ALP活性较对照组增高明显(P<0.01);茜素红染色可见钙结节形成;骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论:PRP对体外培养的鼠MSCs增殖及成骨分化活性具有显著的促进作用。     

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.     

骨髓基质细胞的体外培养和成骨方向的诱导分化

目的:体外分离狗的骨髓基质细胞,诱导其成骨分化并鉴定成骨活性.方法:体外分离培养狗的骨髓基质细胞,传代培养中加入10-8rnol/L地塞米松、50 μg/ml维生素C和10mmol/L β-甘油磷酸钠进行诱导分化,进行细胞形态和增殖观察,矿化结节Von Kossa染色,细胞碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测其成骨活性.结果:骨髓基质细胞经诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化结节Von Kossa钙染色阳性;传代细胞碱性磷酸酶染色阳性,酶活性＞80%,Ⅰ型胶原免疫组化染色强阳性.结论:体外分离培养的骨髓基质细胞中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能.     

富血小板血浆对人成骨样细胞MG63增殖能力的影响

目的研究富血小板血浆（PRP）对人成骨样细胞MG63增殖能力的影响,探讨PRP的生物学功能。方法采集健康志愿者的静脉血,两次离心法制备PRP,氯化钙加人凝血酶激活后离心提取PRP萃取液。碱性磷酸酶（ALP）染色检测不同体积分数PRP（0、1%、2%、3%）对MG63分化活性的影响,碘化丙啶（PI）荧光染色观察PRP作用下MG63细胞形态的变化,免疫细胞化学检测PRP对MG63表达转化生长因子-β（TGF-β）的影响,扫描电子显微镜（SEM）观察PRP对MG63在人工骨材料表面生长情况的影响,CCK-8法检测PRP对MG63增殖活性的影响,流式细胞术（FCM）检测经PRP培养后不同时间MG63的细胞周期,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PRP作用下MG63中Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）mRNA的表达量。结果ALP检测见3%PRP组ALP阳性细胞染色最深,并随体积分数的增加染色强度增加,且PRP组细胞均出现不同程度的脱片现象。PI荧光染色见PRP组细胞核荧光染色较对照组增强。免疫细胞化学检测见3%PRP组TGF-β表达量最高（P＜0.05）。SEM观察：PRP组材料表面MG63密集,生长状态良好。CCK-8法测定细胞增殖活性,显示4.8%PRP组吸光度A450 nm值高于对照组（P＜0.05）。FCM检测表明：PRP组第2天S期细胞百分比高于对照组（P＜0.05）;第10天PRP组G0/G1期细胞百分比高于对照组（P＜0.05）;除第6天外,PRP组G2/M期细胞百分比均高于对照组。RT-PCR结果表明：PRP组MG63的Col-ⅠmRNA表达量较对照组明显上调。结论适宜体积分数的PRP对MG63的增殖、迁移和相关蛋白、基因的表达有促进作用,PRP具有统一、协调细胞生物学行为的作用。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

富血小板血浆对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨影响的实验研究

体外分离、培养rBMSC,经细胞表面标记物检测和体外诱导分化鉴定后,分别采用MTT法检测PRP对细胞增殖活性的影响;细胞化学法检测PRP对成骨诱导后rBMSC碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)活性的影响;RealTime-PCR检测PRP对细胞成骨分化指标Col-3、OPN mRNA表达水平的影响;扫描电镜观察PRP对rBMSC在Bio-Oss上粘附的影响。结果:rBMSC传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;细     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

富血小板血浆对根尖乳头干细胞增殖及矿化的影响

目的：探讨不同浓度富血小板血浆（Platelet—rich plasma,PRP）对根尖乳头干细胞（Stem cell from the apical papilla,SCAP）增殖及矿化的影响。方法：两步离心法制备PRP,通过ELISA的方法测定PRP中血小板源性生长凶子（PDGF—AB）和转化生长因子（TGF—B1）的浓度;CCK-8法、ALP活性检测法观察5％、10％、15％、20％PRP与对照组在1d、2d、3d、4d、5d、6d时对根尖乳头干细胞增殖及矿化作用的影响。结果：PRP中血小板浓度大于全血中血小板浓度,为全血中的5倍以上。CCK-8法测定不同浓度组的PRP对根尖乳头细胞增殖均有促进作用,以10％PRP增殖作用显着,P〈0．05。PRP组与对照组相比,3d时,ALP活性无显著性差异（P〉0．05）;6d时,差异有显著性（P〈0．05）。结论：PRP对根尖乳头干细胞的增殖及矿化均具有促进作用,以10％PRP增殖效应最为显著。     

生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石支架的骨传导性体外研究

目的:通过体外实验对新型生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石(CAP)支架材料的骨传导性进行评价。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,向成骨诱导后,定植于不同孔隙率及不同碳酸根含量的CAP支架材料上共同培养,通过扫描电镜、细胞黏附及增殖检测(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)定量检测、骨钙素(OCN)定量检测,评价成骨细胞在支架材料上的附着、增殖和分化情况。结果:成骨细胞定植于不同孔隙率及碳酸根含量的支架材料上,4 h均已开始黏附、且增殖情况良好。分化实验中,ALP和OCN在各组支架材料分化良好。不同孔隙率支架材料组间比较,40%孔隙率的实验组对ALP分化的促进作用有明显优势。结论:CAP支架材料有良好的生物相容性和骨传导性,是一种良好的组织工程支架材料。     

淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞增殖、成骨和成脂分化的影响

目的:研究淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和成骨、成脂分化的影响。方法:将淫羊藿苷配制成终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L的溶液,以0 mol/L组为空白对照组,分别用于体外培养犬BMSCs。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。然后实验分为淫羊藿苷组和对照组,分别在含或不含成骨、成脂诱导液条件下,行成骨、成脂诱导分化实验,通过茜素红和油红O染色检测各组钙沉积和脂质形成面积。结果:发现淫羊藿苷1×10-6 mol/L组促进犬BMSCs增殖,而1×10-4mol/L组抑制增殖。碱性磷酸酶活性与淫羊藿苷浓度呈剂量依赖性关系。不含成骨、成脂诱导液条件下,各组均几乎未见明显钙沉积和脂质形成;含成骨、成脂诱导液条件下,淫羊藿苷组(1×10-6 mol/L)钙沉积面积高于对照组,脂质形成面积低于对照组。结论:淫羊藿苷能促进犬BMSCs增殖和成骨分化,并抑制其成脂分化。     

骨髓间充质干细胞与支架材料nHA/PA66复合培养的生物活性研究

目的：研究骨髓间充质干细胞与支架材料-纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nHA/PA66）复合培养时生物学特性。方法：体外培养兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,并分为A、B、C、D四组。A组为对照;B组和D组进行骨向诱导;同时,C组和D组细胞与nHA/PA66复合培养。应用MTT实验、碱性磷酸酶（ALP）染色和生物化学分析、扫描电镜,分别对各组细胞的增殖速度、ALP活性及细胞在支架上的黏附情况进行检测。结果：MTT结果显示,A组细胞增殖曲线与C组相似,而B组和D组相似;A组和C组细胞增殖略高于B组和D组。结果表明,骨向诱导可使细胞增殖轻微下降,而与支架材料复合培养对MSCs增殖无影响。ALP染色及ALP活性生化分析进一步表明,MSCs与支架材料复合培养对其骨向分化能力无影响。SEM观察则表明,C组细胞和D组细胞与支架材料均粘附良好。结论：nHA/PA66适于MSCs的黏附、增殖及骨向分化,是一种极具价值的骨组织工程支架材料。     

低分子釉原蛋白的纯化及其对人牙髓细胞和牙周膜细胞作用的研究

目的：纯化低分子猪釉原蛋白（LMWPA）,并观察其对人牙髓细胞（HDPCs）和牙周膜细胞（HPLCs）增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法：取六月龄猪第二磨牙牙胚牙釉质,用液相色谱法分离纯化LMWPA,分别采用MTT法和酶动力学方法测定LMWPA对HDPCs和HPLCs的体外作用。结果：得到的LMWPA是分子量约为5.0KDa的单一组分;在50和100μg/mL时,能的显著促进HDPCs和HPLCs的增殖,ALP活性上调（P〈0.01）;而在≥150μg/mL时,能显著抑制细胞的增殖,ALP活性下调（P〈0.01）。结论：LMWPA影响HDPCs和HPLCs的增殖和碱性磷酸酶活性,并存在剂量和时间依赖性。     

BMP-2和地塞米松对体外培养大鼠牙囊细胞矿化能力的影响

目的:探讨BMP-2和地塞米松联合作用对大鼠牙囊细胞分化能力的影响,为牙囊细胞在牙周组织工程中的应用提供实验依据。方法:取生长状态良好的第3代大鼠牙囊细胞,血清饥饿同步化后,分别加入含BMP-2(100ng/ml)、地塞米松Dex(10-8mol/ml)、BMP-2(100ng/ml)+地塞米松(10-8mol/ml)的DMEM培养液,通过碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒、钙化结节染色分别检测不同诱导条件下对大鼠牙囊细胞分化的影响。结果:经BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导后,体外培养的大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性均显著高于未诱导组,各组间ALP活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。BMP-2+Dex诱导组ALP活性最强,与BMP-2诱导组间差异有统计学意义(P<0.01),而与Dex诱导组间ALP活性则差异无统计学意义(P>0.01)。培养14d时,BMP-2+Dex诱导组牙囊细胞ALP活性增强最为显著,与BMP-2诱导组及Dex诱导组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。矿化结节计数分析显示,各组细胞矿化结节形成的数量及面积明显存在显著的差异,BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导组与未诱导组相比,其矿化结节形成量差异均有统计学意义(P<0.01),BMP-2+Dex诱导组矿化结节形成量明显大于BMP-2和Dex单独诱导组。结论:BMP-2、地塞米松均能促进牙囊细胞的分化,然而两者联合作用促分化的能力最为显著,提示其在牙周组织工程中的应用前景。     

盐酸二甲双胍对大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响

目的：研究盐酸二甲双胍（MF）对大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响，为糖尿病患者经种植牙给药假说提供实验依据。方法：分离培养原代下颌骨成骨细胞，分别给予不同浓度的MF，MTT法检测大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、生化法测定碱性磷酸酶（ALP）活性、钙吸收、茜素红S钙染法检测矿化结节形成。结果：在一定浓度范围内，MF可以提高成骨细胞数量和ALP活性，促进钙吸收及矿化结节形成。结论：MF能促进原代下颌骨成骨细胞的增殖分化及矿化，提高成骨细胞的成骨能力。