尼古丁诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡的实验研究

目的：了解在体外培养环境中,尼古丁对人牙周膜成纤维细胞凋亡的影响。方法：将尼古丁作用于培养至第6代的人牙周膜成纤维细胞后,通过四唑盐比色法、流式细胞仪研究尼古丁能否诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡。结果：四唑盐比色法证实当尼古丁浓度在0.05～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的抑制呈浓度依赖性,流式细胞仪分析提示,当尼古丁浓度在0.5～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的凋亡率呈浓度依赖性。结论：尼古丁对人牙周膜成纤维细胞有一定的毒性作用,通过抑制牙周膜成纤维细胞增殖和诱导凋亡加重对周膜的破坏。     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响

目的：体外研究尼古丁对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响。方法：用不同浓度的尼古丁与体外培养的人牙周膜成纤维细胞作用不同时间,用MTT比色法测定细胞的生长情况,流式细胞分析法测定尼古丁对细胞周期的影响。结果：各浓度的尼古丁组均能抑制人牙周膜成纤维细胞的生长,但不同浓度尼古丁对牙周膜细胞的抑制作用无明显差异;各浓度组尼古丁均能降低G1的比例,高浓度尼古丁（5×10^-1g/L）组G1期比例降至84.62%,G2/M期升高至12.83%。结论：尼古丁能抑制人牙周膜成纤维细胞的生长,并影响其细胞周期的进程。     

血管内皮细胞对牙周组织细胞增殖的影响

目的：通过血管内皮细胞与牙周组织细胞复合培养模拟牙周组织再生环境,观察血管内皮细胞对牙周组织细胞增殖的作用规律,探讨血管内皮细胞对牙周组织修复再生的影响。方法：应用原代培养的血管内皮细胞,在Transwell嵌套中实现与人牙周膜成纤维细胞、牙龈成纤维细胞间的复合培养,分别于复合培养第2、4、6、8和10天,以细胞计数手段检测血管内皮细胞共存条件下2种牙周组织细胞的增殖情况,并与单独培养的2种牙周组织细胞作为对照,采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：在血管内皮细胞存在条件下,2种牙周组织细胞的增殖速率均显著高于单独培养条件。血管内皮细胞存在时,牙周膜成纤维细胞增殖速率逐渐超越牙龈成纤维细胞(第6天起),并在第8天细胞数量上超过牙龈成纤维细胞,差异具有显著性(P<0.01)。结论：血管内皮细胞的存在,对牙周组织细胞的增殖具有促进作用,对牙周膜成纤维细胞增殖的促进作用显著高于牙龈成纤维细胞。     

IL-1β干预后人牙周膜成纤维细胞中TRAF6的基因表达研究

目的：研究IL-1β干预后人牙周膜成纤维细胞中TRAF6的基因表达水平的变化，为细胞因子网络调控牙周膜成纤维细胞功能的研究提供新资料。方法：采用原代培养的人牙周膜成纤维细胞，取5-8代细胞以IL-1β梯度浓度干预，采用RT-PCR法检测TRAF6在人牙周膜成纤维细胞中的表达。结果：在正常的人牙周膜成纤维细胞中未见TRAF6基因表达，IL-1β干预后，TRAF6呈阳性表达，并且随着IL-1β干预的浓度增高，其表达水平上调。结论：IL-1β干预后TRAF6在HPLFs中的表达水平的变化提示TRAF6可能是参与牙周膜成纤维细胞功能调控的重要信号分子。     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对人牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响,探讨bFGF在牙周组织再生中的意义。方法体外培养人牙周膜成纤维细胞,分别用质量浓度0.1、1.0、10.0 ng·mL-1的bFGF刺激细胞,培养24、48、72 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA表达的变化。结果bFGF可促进人牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA的合成,在培养24、48、72 h时,1.0 ng·mL-1组整合素β1亚单位表达均明显高于对照组;培养72 h时各实验组整合素β1亚单位表达均明显高于培养24、48 h时。结论bFGF通过提高整合素β1亚单位mRNA的表达,促进牙周膜成纤维细胞的黏附,在牙周组织修复再生中起作用。     

前列腺素E2对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达的影响

目的：探讨前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）mRNA表达的影响。方法：将体外培养的人牙周膜成纤维细胞用不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol/L）的PGE2分别处理2、8、24、48h,使用Trizol抽提总RNA,通过半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来观察人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达强度变化。结果：10^-9～10^-6mol/LPGE2在2～24h可上调人牙周膜成纤维细胞RANKL mRNA的表达,但抑制OPGmRNA的表达,且RANKL/OPG比率呈上升趋势。结论：PGE2有可能通过调节人牙周膜成纤维细胞的RANKL/OPG mRNA表达比例,从而间接地调节破骨细胞的分化和活性。     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响,探讨bFGF在牙周组织再生中的意义.方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞,分别用质量浓度0.1、1.0、10.0ng·mL-1的bFGF刺激细胞,培养24、48、72 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA表达的变化.结果 bFGF可促进入牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA的合成,在培养24、48、72 h时,1.0 ng·mL-1组整合素β1亚单位表达均明显高于对照组;培养72 h时各实验组整合素β1亚单位表达均明显高于培养24、48 h时..结论 bFGF通过提高整合素β1亚单位mRNA的表达,促进牙周膜成纤维细胞的黏附,在牙周组织修复再生中起作用.     

体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测

目的　探讨牙周膜成纤维细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法　采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞 ,以人胎儿皮肤成纤维细胞为对照检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。结果　体外培养人牙周膜成纤维细胞与人胎儿皮肤成纤维细胞相比表达更高水平的碱性磷酸酶 (P <0 .0 5 ) ,矿化诱导液连续培养 30d均可观察到矿化结节形成。结论　采用酶消化法可快速简便地获取原代人牙周膜成纤维细胞。体外培养牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征 ,与人胎儿皮肤成纤维细胞相比更具分化潜能 ,可作为牙周组织工程种子细胞来源     

HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达

目的：观察HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达及探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-1β（IL-1β）与HGF之间的关系。方法：分别采用IL-1β梯度浓度、最佳干预浓度和TGF-β1梯度浓度干预第5代人牙周膜成纤维细胞,并运用酶联免疫技术检测人牙周膜成纤维细胞的上清液中HGF的表达。结果：经IL-1β单独作用,人牙周膜成纤维细胞的上清液中HGF的含量较空白对照组高,并优选出IL-1β的最佳干预浓度为10 ng/mL。当一定浓度的TGF-β1和10 ng/mL的IL-1β联合干预人牙周膜成纤维细胞,该细胞上清液中HGF的含量较单独IL-1β作用组低。结论：TGF-β1能够抑制IL-1β诱导的人牙周膜成纤维细胞分泌HGF。     

高迁移率族蛋白B1对牙周膜成纤维细胞表达细胞因子影响的研究

目的观察高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对人牙周膜成纤维细胞表达白细胞介素-6（IL-6）、破骨细胞核因子κB受体活化因子（RANKL）、骨保护因子（OPG）的影响,初步探讨HMGB1在牙周疾病的作用。方法采用原代组织块培养法,培养人牙周膜成纤维细胞,用第4~6代的细胞进行实验。分别用10、30、100 ng·mL-1质量浓度的HMGB1孵育牙周膜成纤维细胞24 h后,RT-PCR检测IL-6、RANKL、OPG的mRNA表达;Western blot法检测RANKL、OPG的蛋白表达。均以0 ng·mL-1质量浓度组为对照,所得数据用单因素方差分析处理。结果HMGB1在10、30、100 ng·mL-1质量浓度时,细胞中的RANKL/OPG mRNA的比值增高（P<0.05）,100 ng·mL-1质量浓度时细胞中的IL-6 mRNA的表达量增高（P<0.05）。Western blot检测结果显示10 ng·mL-1质量浓度组的RANKL/OPG的比值有明显增高。结论一定浓度的HMGB1可使牙周膜细胞中的RANKL/OPG比值增高,还会诱导炎症因子IL-6 mRNA表达上调。提示HMGB1可能会在牙周炎的发病以及炎症进展中发挥作用。     

硝苯地平对静态拉伸下牙周膜细胞MMP-1及MMP-8的表达影响

目的：研究静态机械拉伸作用下,硝苯地平对人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibro-blasts,HPLFs）中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase）MMP-1及MMP-8的调节作用。方法：体外培养HPLFs,按弹性形变将细胞随机分为4组（0%、8%、12%、16%）,每组再按硝苯地平（nifedipine,NIF）药物浓度随机分为4个亚组（0μm、10μm、30μm、50μm）。用机械力装置使细胞持续静态拉伸12 h后,免疫组化检测硝苯地平对HPLFs胞浆中MMP-1和MMP-8的表达所产生的影响。结果：弹性形变0%时,各浓度硝苯地平对MMP-1和MMP-8表达均无明显影响（P〉0.001）;形变8%、12%、16%,硝苯地平0μm时,二者表达随形变增大而增强;加入硝苯地平后,随药物浓度的升高,二者表达逐渐减弱（P〈0.001）。结论：硝苯地平可以抑制静态机械拉伸诱导的HPLFs中MMP-1和MMP-8的表达。     

间接共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞向牙周膜成纤维样细胞分化

目的：探讨通过间接共培养诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向牙周膜成纤维细胞（Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）分化的可行性。方法：将大鼠BMSCs与PDLFs间接共培养,分别于不同时间段检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）、Ⅲ型胶原（Collagen typeIII,COLⅢ）mRNA表达的变化。结果：间接共培养后的BMSCs表现出类似PDLFs的性质,各检测指标与单独培养的PDLFs无统计学差异,与单独培养的BMSCs有统计学差异。结论：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓间充质干细胞向其分化。     

LPS刺激对体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶表达的影响

目的检测脂多糖（LPS）刺激后体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶-1和环氧合酶-2（COX-1,COX-2）表达的改变,探讨牙龈成纤维细胞与牙周炎症发生发展的关系。方法组织块法原代培养正常人牙龈成纤维细胞并进行来源鉴定,MTT法检测不同浓度LPS刺激后活细胞数量的改变;以10ug/ml刺激第4代细胞,24h后用免疫细胞化学方法检测COX-1和COX-2在细胞中的表达,多功能彩色细胞分析管理系统进行图像分析和统计学分析。结果 LPS刺激可使牙龈成纤维细胞的增殖速度降低,生长曲线大致呈＂S＂形;10ug/ml LPS刺激24h后细胞数量未见明显变化。免疫细胞化学染色结果显示COX-1在LPS刺激前后均有表达但无显著差异（P〉0.05）,COX-2在LPS刺激前无表达,LPS刺激后则表达增强并有显著差异（P〈0.01）。结论 LPS对牙龈成纤维细胞生长增殖有抑制作用,不影响COX-1的表达强度,但可使COX-2表达显著增强,说明牙龈成纤维细胞对LPS刺激的反应可能影响牙周炎症进展。     

胰岛素在高糖环境诱发牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用

目的:探讨胰岛素在高糖环境下牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用。方法:本实验采用含有不同葡萄糖浓度的培养基培养人牙周膜细胞,并采用胰岛素作治疗对照,作用24小时后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞进行计数,最后进行统计学分析。结果:葡萄糖浓度增至15mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例无显著增加(3.47±0.78 VS 3.03±0.40,P>0.05),当葡萄糖浓度增至25mmol/L和35mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例显著增加(5.07±0.611 VS 3.03±0.40,P<0.01;7.13±0.72 VS 3.03±0.40,P<0.01),加入胰岛素后,牙周膜细胞凋亡比例显著下降(7.13±0.72 VS 5.23±0.85,P<0.01),但仍然高于正常糖浓度组(5.23±0.85 VS3.03±0.40,P<0.01)。结论:胰岛素能够部分抑制高糖环境诱发的牙周膜细胞凋亡。     

羧甲基壳聚糖对LPS干预人牙周膜成纤维细胞表达IL-6的影响

目的：脂多糖（LPS）干预下,不同浓度羧甲基壳聚糖（CMC）对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）表达白细胞介素-6（IL-6）的影响。方法：取冻存的HPDLFs进行复苏培养,以浓度为10mg／L的LPS进行诱导,用不同浓度的羧甲基壳聚糖进行干预,采用免疫组织化学方法检测IL-6在HPDLFs中的表达变化。结果：不同浓度羧甲基壳聚糖能够下调同一浓度LPS诱导的HPDLFs表达的IL-6,随羧甲基壳聚糖浓度的增加,IL-6的表达量呈逐渐减弱趋势（P〈0．05）。结论：羧甲基壳聚糖可能对LPS诱导的HPDLFs炎症损伤过程中表达IL一6有重要的抑制作用,为牙周病治疗提供新的实验资料。     

人与犬牙周膜干细胞的生长特性比较

目的：培养、分离人与犬牙周膜干细胞（PLSCs）,比较其生长特性,为相关体内研究提供理论和实验依据。方法：采用免疫磁珠分选系统分别从原代培养的人与犬牙周膜细胞中分离PLSCs,通过倒置相差显微镜、细胞计数、集落形成检测、流式细胞仪等方法比较人与犬PLSCs的细胞形态、生长曲线、集落形成率（CFR）及STRO-1^＋表达情况。结果：人与犬PLSCs形态相似,均为梭形,生长曲线也都呈“S”形。但CFR人PLSCs显著高于犬PLSCs（P〈0．05）,而且人牙周膜中STRO-1^＋细胞的表达率高于犬牙周膜中STRO-1^＋细胞（P〈0．05）。结论：STRO-1^＋免疫磁珠分选系统可用于分离人和犬PLSCs,所分离的两种PLSCs的形态和体外生长模式相似,但细胞亚群增殖能力和表型有差异。     

淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

目的：探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响,为淫羊藿苷在治疗牙周病方面的应用提供一定依据。方法：体外培养人牙周膜细胞,矿化诱导条件下将第3代细胞与10～0.001mg/L,6个浓度的淫羊藿苷作用,通过噻唑蓝（MTT）比色法、ALP活性测定及BSP表达水平,反应其对人牙周膜细胞增殖及分化的影响。结果：作用24h,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用48h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）。作用72h,0.1～0.001mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖（P〈0.05）,10mg/L组抑制人牙周膜增殖（P〈0.05）;作用72h,1～0.001mg/L组可促进人牙周膜碱性磷酸酶（ALP）活性（P〈0.05）;作用72h,0.1～0.001mg/L组的BSP表达水平较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化。     

人乳牙牙周膜干细胞的生物学特性研究

目的:体外分离纯化人乳牙牙周膜组织来源的干细胞,研究其生物学特性、表面标记物及多向分化能力。方法:用酶消化法和有限稀释法对正常人乳牙牙周膜组织进行原代培养,并通过免疫细胞化学方法和流式细胞仪对其来源进行鉴定,进而从增殖能力、克隆形成能力和多向分化能力等方面对乳牙牙周膜干细胞的生物学特性进行研究。结果:分离培养获得的人乳牙牙周膜干细胞在形态上与恒牙牙周膜干细胞相似,均为长梭形成纤维细胞样;免疫细胞化学和流式细胞仪分子表型鉴定显示乳牙牙周膜干细胞阳性表达间充质来源的表面标志STRO-1,CD146,CD29和CD90,造血系来源的标志物CD34为阴性;细胞周期,MTT和克隆形成率的检测结果显示,人乳牙牙周膜干细胞的增殖能力强于恒牙牙周膜干细胞;人乳牙牙周膜干细胞在体外诱导条件下可以向骨,脂肪细胞方向分化;同时RT-PCR检测发现,矿化诱导后细胞成骨相关基因(ALP,OCN,Col I)的表达上调,成脂诱导后细胞成脂相关基因(PPAR-γ,C/EBPα)的表达上调。结论:人乳牙牙周膜中确实存在间充质来源的干细胞,并且具有较强的增殖能力和多向分化能力,为牙周组织工程种子细胞提供了新的可能来源。