人凝血因子IX在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ix（hFIX蛋白）在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFIX表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组hFIX。方法首先用RT-PCR将人肝脏hFIX的mRNA进行扩增、测序并插入到pPIC9K中载体,构建pPIC9K—hFIX酵母分泌表达载体,再将pPIC9K—hFIX电转化进入毕赤酵母SMDl168,然后通过G418抗药性能力的大小筛选获得高拷贝且表达量高的重组菌株。结果通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表明本研究获得的重组毕赤酵母hFIX表达量达到100mg／L;经过阴离子交换和半透膜扩散透析得到纯化的蛋白。检测重组hFIX的比活力,约为天然hFIX凝血活性的5．5％。结论我们可以优化找到更好的生产条件,使用其他比SMDll68更好的菌株,以获取更好生产量和质量;另外,我们也有很多可以增强在酵母生产的hFIX的活性。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆人内皮抑素 (hES)全长cDNA ,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法 :用RT PCR从胎肝RNA中扩增hEScDNA片段 ,构建重组其克隆和融合蛋白表达载体 ,并进行克隆基因的DNA序列分析。结果 :克隆了hEScDNA ,其序列和国外报道一致 ;构建了重组hES融合蛋白表达菌株 ,表达目的蛋白达菌体总蛋白的5 0 %以上。结论 :通过hES基因克隆和表达的研究 ,获得了hES的基因克隆和高效表达菌株     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

乳糖诱导重组人内皮抑素在大肠杆菌中的表达

使用乳糖作为诱导剂,摇瓶培养大肠杆菌Origami(pET-hES)发酵生产重组人内皮抑素,优化了诱导温度、诱导时机、诱导时间及诱导剂浓度四因素.利用SDS-PAGE电泳检测并分析上述各因素的优化效果.结果表明,25℃,在菌株对数生长初期(培养6 h,D600=0.8)加入乳糖至终浓度为8 g/L,诱导14 h,可溶性目的蛋白表达量占其总表达量的82%;总目的蛋白表达量占全菌总蛋白的35%,优于以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂的诱导效果(25%).     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的　利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin ,并对其进行生物学活性鉴定。方法　采用RT-PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA ,将其克隆入pGEM-TEasy克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450-1 ,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG₁中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果　成功获得549bp人endostastin基因,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论　人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin,并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA,将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。     

人白介素－12在毕赤酵母中的表达、纯化与活性测定

人IL－12是目前发现的白细胞介素中对人体免疫活性细胞诱导和调节作用最强和范围最广的一种。具有广阔的应用前景。目前,IL－12的重组表达主要使用高等真核表达系统。我们构建了pPIC9k－p35和pPICZα－p40重组质粒,共转化毕赤酵母KM71菌株,获得可以同时表达 IL－12双亚基的稳定表达株,通过离子交换亲和层析、疏水亲和层析进行纯化,获得的 rhIL－12样品纯度大于97％,总得率大于60％,降低了工艺难度,有利于进一步大规模制备工作的开展。此外,本研究才用的纯化工艺获得的纯化样品纯度＞97％,得率＞60％,经 PBMC 细胞法测定,比活性达到1．36×107 IU? mg －1,与商品化的rhIL－12标准品相当,为规模化制备和进一步研究应用提供了坚实的基础。     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统 ,由于其有许多突出的优点 ,越来越受到分子生物学界的重视 ,已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述 ,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

人ω干扰素基因工程菌发酵条件的优化

目的对表达人ω干扰素(in terferon,ωIFN-ω)的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得ω干扰素的最高表达量。方法设计三因素三水平正交实验方案,用直观分析法分析来确定出最佳的发酵条件。结果用FBS培养基发酵的最佳条件是:温度28℃,溶氧50%,甲醇浓度1%,pH 7.0。结论通过发酵条件优化后,ω干扰素表达量达到了90m g.L-1。     

人组织因子的密码子优化及其在毕赤酵母中的高水平发酵制备

优化人组织因子编码序列利用毕赤酵母表达系统高水平发酵制备重组人组织因子。将人组织因子胞外活性区(hTF219)编码序列进行密码子偏爱性、GC含量及富AT区的优化,优化序列电转入毕赤酵母表达系统;利用博莱霉素(Zeocin)梯度抗性平板筛选出高表达转化子;在1L发酵罐中采用混合碳源连续补料方式发酵制备重组蛋白。替换hTF219编码cDNA的165个碱基,获得的优化序列与原始序列的相似性为75%;在Zeocin浓度为500μg/mL的YPD平板上筛选得到高表达转化子tfPP-502,该重组菌株以组成型方式分泌表达重组人组织因子,在1L发酵罐中发酵110 h胞外总蛋白含量为6.27 g/L,目的蛋白占比约80%。在毕赤酵母表达系统中实现了重组人组织因子的高水平发酵制备获得的重组菌株可用于重组人组织因子的大规模发酵制备。     

改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析

利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高。应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了最佳摇瓶发酵条件:培养基最适pH值5.5~6.5,最佳甲醇诱导浓度为1%,最适甲醇诱导周期为96h。筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS115、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS115、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性。对TRAIL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达。     

毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析

为了探索利用毕赤氏酵母系统表达和生产人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,hGM-CSF)的可行性,使用经改造的hGM-CSF基因构建pGAPZα-A/hGM-CSF分泌型表达载体,转入毕赤氏酵母SMD1168(his 4,pep 4)菌株和GS115(his 4)菌株,利用斑点杂交技术筛选hGM-CSF基因阳性菌株,利用SDS-PAGE和TF-1依赖细胞株/MTT比色法对工程菌株的分泌产物进行表达和生物活性分析,最后筛选得到7个hGM-CSF基因阳性菌株,其中有3个工程菌株的杂蛋白较少且主带蛋白质相对分子质量与经改造的hGM-CSF基因相对分子质量保持一致,这3个工程菌株的分泌蛋白质样品都具有天然hGM-CSF的生物活性,经初步提取,活性单位分别为2.28×105U/ml、2.22×105U/ml和2.46×105U/ml.从而证明利用毕赤氏酵母系统表达hGM-CSF是可行的,为hGM-CSF的生产和临床应用打下了基础.     

新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438。此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3%、38%。将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达。将此3种重组毕赤酵母GS115(pHBM730)、KM71(pHBM730)、SMD1168(pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究。分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃。在最适反应条件下测得其酶活力为19.64 U。此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

通过正交设计对毕赤酵母GS115/pPICZaAN-hbsp工程菌的发酵条件(菌体密度、甲醇诱导浓度、初始pH值、诱导时间)进行优化.采用重组人骨唾液蛋白(recombinant lauman bone sialoprotein,rhBSP)单克隆抗体与Aldehyde-Resin HP FF介质偶联制备免疫亲和层析柱,纯化非融合型rhBSP,并用Western blotting和补体抑制实验检测非融合型rhBSP的抗原性和活性.毕赤酵母GS115/pPICZαAN-hbsp工程菌最佳发酵优化为:菌体密度OD600达到45甲醇诱导剂量为1.5%,pH值6.0,诱导时间2 d,最大表达量为0.126 mg/ml.经免疫亲和层析法纯化后,SDS-PAGE显示非融合型rhBSP为43～66 ku的分散条带,纯度在90%以上,Westernblotting显示rhBSP具有良好的抗原性,补体实验证明纯化的非融合型rhBSP活性很好.毕赤酵母GS115/pPICzαAN-hbsp工程菌发酵条件经优化后能高效表达非融合型rhBSP,应用免疫亲和层析方法纯化的非融合型rHBSP纯度好,活性高,为进一步研究非融合型rHBSP打下了基础.     

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。     

重组人血管内皮抑制素联合博来霉素治疗恶性胸腔积液的临床研究

目的观察重组人血管内皮抑制素联合博来霉素治疗恶性胸腔积液的近期疗效及安全性。方法 30例恶性胸腔积液患者随机分为2组,试验组应用重组人血管内皮抑制素联合博来霉素胸腔内灌注,对照组应用博来霉素胸腔内灌注,评估2组近期疗效、KPS评分和不良反应。结果试验组和对照组的有效率分别是86.7%和66.7%（P〈0.05）,生活质量改善率分别是80.0%和53.3%（P〈0.05）,未出现严重不良反应。结论重组人血管内皮抑制素联合博来霉素是治疗恶性胸腔积液的一种安全、有效的方法。