肾小球系膜细胞的分离和培养

目的分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞,同时采用免疫荧光技术,利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体:抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性,而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性,说明培养的细胞为系膜细胞。结论该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的 分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法 筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞，同时采用免疫荧光技术，利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体；抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果 抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性，而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性，说明培养的细胞为系膜细胞。结论 该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

人肾小球系膜细胞原代培养及鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、传代次数多的人肾小球系膜细胞培养方法。方法：取肾脏肿瘤手术切除后远离患病部位的正常肾脏组织、水囊引产的胎儿肾,三层筛网滤过分离,取最下层筛网上组织,用胶原酶消化,培养正常人肾小球系膜细胞。同时采用形态学观察和免疫荧光技术,对鼠抗人结蛋白,鼠抗人角蛋白进行鉴定,采用MTT、 流式细胞仪技术对不同来源肾脏的系膜细胞生长状况进行比较。结果：形态学、免疫荧光法鉴定表明培养细胞为肾小球系膜细胞,胎肾原代培养后8～10d即可传代,而成年肾脏原代培养后需15～16d方可传代。成年肾脏培养细胞至第4代细胞生长缓慢,贴壁能力减弱,出现死亡。而胎肾培养细胞则可继续培养至第7～10代。结论:三层滤网法分离人肾小球系膜细胞, 方法简单、高效,培养的原代肾小球系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特性,且进一步证明胚胎组织比成年个体肾脏原代细胞培养容易成功。     

低密度脂蛋白对体外培养的肾小球系膜细胞表型转化的影响

目的通过低密度脂蛋白(LDL)的刺激,观察LDL对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表型转化的诱导作用。方法采用不同浓度的LDL(0,25,50,100,150μg/ml)刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞的水平,以台盼蓝染色检测LDL对系膜细胞的毒性作用,MTT比色法检测细胞增殖,透射电镜观察系膜细胞的形态学变化,免疫细胞化学染色及Western blot检测α-SMA、CTGF、Ⅳ型胶原及FN的表达。结果在LDL作用下,倒置显微镜下细胞变为长梭形,透射电镜下细胞表面微绒毛减少。免疫细胞化学染色及Western blot显示α-SMA、CTGF、Ⅳ型胶原及FN表达增强。结论在LDL刺激下,系膜细胞可以发生表型转化。     

祛风通络方对系膜增生性肾小球肾炎大鼠肾组织α-SMA的影响

目的：通过观察肾脏组织形态学及肾小球α-SMA表达的变化,探讨祛风通络方防治大鼠系膜增生性肾小球肾炎的可能机制,为祛风通络方的临床应用提供理论依据.方法：采用免疫法制备MsPGN大鼠模型,光镜下观察各组大鼠肾小球系膜区（GMC）及细胞外基质（ECM）积聚变化.采用免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织中α-SMA的表达,并用图像分析系统对免疫组织化学结果进行灰度值分析.结果：肾小球及肾小管α-SMA灰度值病理组为167.91±6.16,空白对照组为195.88±3.49,两者相比较差异具有统计学意义（P〈0.05）;肾小球及肾小管α-SMA灰度值祛风通络方组为200.71±2.29,蒙诺组为201.68±1.37,与病理组相比,2组灰度值明显升高（P〈0.05）,2治疗组与空白对照组相比灰度值虽有所升高但差异无显著性.肾组织形态学观察显示,祛风通络方组个别区域肾小球系膜细胞轻度增生,系膜区轻度增宽,管腔无挤压现象,较模型组明显改善.结论：祛风通络方能够抑制肾组织α-SMA的表达,影响肾小球系膜细胞的重塑,该方可减轻MsPGN模型大鼠肾组织病理损害,延缓肾小球硬化的进展.     

大鼠肾小球系膜细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探索一种重复性好、传代次数多的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)体外培养和鉴定的方法.方法:麻醉状态、无菌条件下取得大鼠的肾脏,用3种不同目数的不锈钢筛网提取肾小球,搜集到的肾小球分别加入2.5 g/L、0.5异/LⅣ型胶原酶及2 g/L Ⅱ型胶原酶各5 mL,分别在37 ℃水浴箱中振荡消化20 min、30 min、25min,然后接种肾小球,比较不同培养条件下肾小球系膜细胞的生长状况.结果:Ⅱ型、Ⅳ型胶原酶3种不同浓度作用不同的消化时间,细胞的生长速度及生长状况不同,Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的为最佳.结论:培养的细胞为肾小球系膜细胞,用Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的肾小球系膜细胞生长状态最佳.     

大鼠Thy-1肾炎增殖病变及sublytic C5b-9致其肾小球系膜细胞增生的实验研究

目的:检查大鼠Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)的增生病变及亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物在GMC增殖中的作用?方法:复制大鼠Thy-1N模型,分别于注射Thy-1抗体后18 h?3 d和7 d时,取肾组织,用real-time PCR和Western blot方法检查其肾组织中细胞增殖指标,即细胞周期蛋白D2(cyclin D2)和增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen,PCNA)的mRNA丰度及蛋白表达水平?用免疫荧光观察肾小球中C5b-9复合物的沉积?同时,使用BrdU掺入法?光镜及电镜观察大鼠肾小球细胞的增殖情况?此外,体外培养大鼠GMC,进行不同分组处理后再给予sublytic C5b-9刺激,用3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入法(3H-thymidine incorporation,3H-TdR)检查GMC的增殖情况?结果:大鼠Thy-1N病变18 h,肾组织中cyclin D2?PCNA表达和肾内BrdU阳性细胞数均开始升高,实验3 d和7 d,其表达进一步提高?同时肾小球内可见C5b-9复合物沉积,部分C5b-9包绕的肾细胞形态完好?另形态学观察还发现,实验18 h,部分GMC溶解坏死,而实验3 d,GMC数量明显增多,7 d增加更为显著?体外实验中,大鼠GMC在sublytic C5b-9刺激后18 h,其细胞增殖水平显著增高,而用sublytic C5b-9刺激GMC产生的培养上清处理正常的GMC后,亦能轻度刺激GMC增殖?结论:大鼠Thy-1N肾小球病变存在早期增殖和继发增生的病理改变,而GMC的早期增殖可能与sublytic C5b-9作用有关?     

猕猴原代肾小球系膜细胞分离提取培养与鉴定

目的 探索一种简单方便、重复性好的非人灵长类动物原代肾小球系膜细胞(GMCs)体外提取、培养及鉴定的方法。方法 在无菌条件下取出猕猴肾脏,利用两种不同孔径的纱网(介于100目到200目之间)分离出肾小球,设置不同浓度(0.1、0.2 mg/ml)Ⅵ型胶原酶消化肾小球,同时在这两个浓度基础上设置不同消化时间(10、15 min),将消化后的肾小球接种到细胞瓶中,观察不同消化条件下GMCs的生长状况。显微镜下观察GMCs的结构,免疫荧光和Western blot法检测GMCs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Nephrin蛋白的表达。利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后观察GMCs生物学特性,CCK-8法和高内涵细胞成像系统法分别检测GMCs活力和增殖情况;Transwell法和细胞划痕实验检测GMCs迁移能力。结果 利用0.1 mg/mlⅥ型胶原酶消化10 min搜集到的肾小球贴壁较多,肾小球细胞生长状态较好。原代培养的肾小球3 d贴壁,7 d开始移出不规则形状或星状的细胞,经21～35 d GMCs逐渐铺满瓶底。GMCs中α-SMA蛋白阳性,Nephrin蛋白阴性。10 ng/m...     

随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞及其鉴定

目的 寻找一种培养及鉴定大鼠主动脉内皮细胞的简便方法.方法 采用随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞并用差速消化法加以纯化,观察细胞形态学特性,用抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验鉴定.结果 培养3d即有细胞生长,1周可融合成层.抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验阳性.结论 本方法简便易行,适于推广应用.     

原代肾小管上皮细胞的培养和鉴定

目的:建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养及鉴定方法.方法:采用研磨、消化培养法,用免疫细胞化学和RT-PCR鉴定细胞.结果:培养的细胞CK18蛋白表达阳性,基本没有α-SMA 和Vimentin的蛋白表达,E-cadherin mRNA强表达.结论:成功建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养方法,为肾脏疾病的研究提供实验平台.     

海昆肾喜对肾小球系膜细胞增殖及表达PDGF-BB mRNA的影响

目的:探讨海昆肾喜对体外培养的肾小球系膜细胞增殖及表达血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)mRNA的影响。方法:制备大鼠含药血清,MTT比色法检测海昆肾喜对脂多糖诱导下肾小球系膜细胞(GMCS)增殖的影响,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测海昆肾喜对GMCS表达PDGF-BB mRNA的影响,设苯那普利为对照组。结果:MTT实验各时间点海昆肾喜组OD值均显著低于LPS组(P<0.05),RT-PCR实验海昆肾喜组PCR产物电泳条带较脂多糖组明显减弱(P<0.05),且均呈量效依赖关系,海昆肾喜大剂量组作用优于小剂量组。结论:海昆肾喜抑制脂多糖诱导的肾小球系膜细胞增殖并显著下调肾小球系膜细胞表达血小板源性生长因子-BB mRNA,可能是其防治肾小球硬化的作用机理之一。     

肾小球上皮细胞分泌肾上腺髓质素抑制系膜细胞增殖

目的 探讨肾上腺髓质素（AM）及其受体CRLR在培养的大鼠肾小球上皮细胞（GEC）和系膜细胞（MsC)的表达,以及AM对MsC生长的影响。方法 采用RT－PCR法分别制备AM及CRLR探针,Northern blot法检测其在GEC和MsC的表达,[^3H]胸腺嘧啶掺入法测定MsC增殖情况。结果 AM仅表达于GEC,不表达于MsC,而其受体CRLR的表达则相反。含有A,的GEC培养上清可抑制MsC生长,而CRLR阻断剂CGRP8－37可部分消除此抑制作用。结论 GEC可通过合成和分泌AM抑制MsC增殖,提示AM作为一种重要的旁分泌因子,以保持肾小球微环境稳定,并参与肾小球的炎症过程。     

精-甘-天-丝四肽对肾小球系膜细胞凋亡相关基因的作用

目的探讨精氨酸－甘氨酸－天门冬氨酸－丝氨酸（ＲＧＤＳ）四肽对肾小球系膜细胞凋亡相关基因白细胞介素－１β－转化酶（ＩＣＥ）和ｂｃｌ－２表达的影响,为利用ＲＧＤＳ四肽调控系膜细胞的增殖与凋亡提供实验理论依据。方法合成ＲＧＤＳ四肽,采用经典的肾小球系膜细胞培养方法进行体外研究;碘化丙啶染色法观察凋亡细胞细胞核的固缩、碎裂现象;琼脂糖凝胶电泳法观察凋亡细胞核小体ＤＮＡ的断裂现象;逆转录－聚合酶链反应技术检测凋亡相关基因ＩＣＥ和ｂｃｌ－２的表达变化。结果与ＲＧＤＳ四肽孵育１０小时后,肾小球系膜细胞出现了典型的凋亡征象,诸如细胞核固缩、碎裂和ＤＮＡ梯形条带等;同时,ＲＧＤＳ四肽处理组的ＩＣＥ和ｂｃｌ－２表达亦明显高于对照组。结论在ＲＧＤＳ四肽诱导的肾小球系膜细胞凋亡过程中,ＩＣＥ和ｂｃｌ－２基因对细胞凋亡可能具有重要的调节作用。     

黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察高糖环境下黄芩苷对肾小球系膜细胞株HBZY- 1增殖和凋亡的影响。方法 采用MTT法观察高糖环境下3种接种浓度的肾小球系膜细胞株HBZY- 1的生长情况,确定该细胞的最佳接种浓度和用药时间点,继而采用MTT法检测黄芩苷对肾小球系膜细胞增殖的影响;运用倒置荧光显微镜观察黄芩苷对肾小球系膜细胞形态的影响;采用流式细胞仪检测不同浓度黄芩苷对肾小球系膜细胞凋亡的影响。结果 高糖环境下,肾小球系膜细胞的最佳接种浓度是2×103/mL,最佳用药时间是细胞培养48 h后。随着浓度升高,黄芩苷抑制HBZY- 1细胞增殖的作用增强。流式细胞仪检测结果显示,高糖环境下,肾小球系膜细胞总凋亡率随着黄芩苷作用剂量的增大而升高,黄芩苷浓度为6.25 μmol/L时,HBZY- 1细胞的总凋亡率与模型对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;当黄芩苷浓度增至12.5 μmol/L时,HBZY- 1细胞的总凋亡率开始显著大于模型对照组（P<0.05）。结论 黄芩苷能够抑制高糖环境下肾小球系膜细胞株HBZY- 1的增殖,在一定浓度范围内呈现明显的量效关系。     

甲羟戊酸对人类肾小球系膜细胞增殖的影响

目的探讨甲羟戊酸(MVA)对人类肾小球系膜细胞(HMC)增殖的作用和机制。方法用酶联免疫检测仪检测不同浓度MVA作用下HMC在490 nm波长处的光吸收(A490 nm)值以测定不同浓度和时间点MVA作用下HMC的增殖水平。结果MVA在10-100 nmol/L范围内对HMC增殖有促进作用,且作用呈浓度依赖性,100 nmol/L MVA作用下A490 nm值从正常组0.408±0.019上升到0.509±0.011。100 nmol/L MVA对HMC的增殖作用在12-48 h内呈时间依赖性。12,24,48 hA490 nm值分别为0.201±0.040,0.326±0.019,0.509±0.011。结论MVA是HMC增殖的促进剂。     

Effects of peripheral blood mononuclear cells from idiopathic nephrotic children on cultured rat glomerular epithelial and mesangial cells

Objective To investigate the effect of immune cell from idiopathic nephrotic children on e xtracellular matrix (ECM) synthesis by cultured rat glomerular epithelial cell ( GEC) and on the proliferation of mesangial cell (GMC).Methods Twenty- eight children with idiopathic nephrotic syndrome and 15 age- matched he althy children were randomly selected and divided into 4 groups: Group 1, untrea ted nephrotic children; Group 2, glucocorticoid treated nephrotic children; Grou p 3, children undergoing glucocorticoid treatment with negative proteinuria; and Group 4, normal control. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were c ollected from these children and PBMC conditioned medium (PBMC- CM) were prepa red. The PBMC- CM was co- cultured with GEC and GMC respectively. The concentr ations of collagen, laminin, collagen Ⅲ and collagen Ⅳ in the GEC and PBMC- CM co- culture medium were investigated. The GMC proliferation was measured by th e (3)H- thymidin incorporation method.Results The (3)H- proline incorporation coefficients of the GEC treated with the PBMC- CM of the 4 groups were 0. 93, 1. 24, 1. 23, and 1. 11, respectively. The laminin inhibitory coefficients of the 4 groups were 0. 95, 1. 02, 1. 01, and 1. 04, res pectively. The inhibitory coefficients of collagen Ⅲ were 0. 97, 1. 00, 0. 99, and 1. 01, respectively, for the 4 groups. All these parameters showed a sign ificant difference between Group 1 and the other 3 groups (P&lt;0. 05). However, there was no si gnificant difference in the inhibitory coefficient of collagen Ⅳ between each t wo o f the 4 groups (1. 04, 1. 05, 1. 04, 1. 08, P&gt;0. 05). The (3)H- t hymidine incorporation coefficients of GMC responsive to PBMC- CM were 1. 21, 1. 53, 1. 5 0 , and 1. 10, respectively, and no significant difference was found between the 4 groups (P&gt;0. 05).Conclusion The results suggested that the circulating immune cells from idiopathic nephroti c children have a direct effect on some ECM component synthesis in cultured rat GEC; the bio- activity of immune cells could be neutralized by administering glucocorticoid; and the circulating immune cells of nephrotic children have no direct effect on GMC proliferation.     

青蒿琥酯对大鼠肾小球系膜细胞细胞周期的影响

目的 观察青蒿琥酯（An）对大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells,GMC）细胞周期的影响。方法 用不同浓度的青蒿琥酯刺激多糖诱导增殖的大鼠肾小球系膜细胞,流式细胞仪检测其细胞周期的变化。结果 青蒿琥酯使细胞有丝分裂被阻滞于G0期,S期细胞比例下降,G0期细胞比例增加。结论 青蒿琥酯能够抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖,这种作用可能是通过其抑制细胞分裂、复制实现的。     

肾康注射液对肾小球系膜细胞增殖及自分泌FN的效应

目的：探讨肾康注射液（SKI）阻抑肾小球硬化（GS），防治慢性肾功能衰竭（CR）的部分作用机制，为SKI临床应用提供依据。方法：采用血清药理学实验法，观察SKI对体外培养人肾小球系膜细胞（GMC）增殖及其自分泌纤维连接蛋白（FN）水平的影响，结果：SKI及其含药血清对GMC增殖，自分泌FN有明显抑制作用（P＜0．01，P＜0．05），呈剂量或SKI血药浓度与效应依赖性；但随刺激时间延长，其作用存在差异，即对增殖的抑制效应：SKI呈递增趋势，而SKI含药血清则呈递减趋势，对FN水平的抑制效应则相反。结论：SKI经机体代谢，药理效应的不一致性，提示SKI含药血清可能出现提高FN降低解酶活性的新物质，或存在降解FN的某种活性成分。     

ET—1对系膜细胞增殖和前胶原mRNA表达的影响

目的利用已构建的体外肾小球系膜细胞（MC）三维立体培养系统，研究内皮素（ET－1）是否具有刺激MC增殖和表达Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原mRNA作用。方法3H－TdR掺入法和斑点杂交方法。结果在0．5％小牛血清存在下，10－7mol／LET－1作用12h后，MC对3H－TdR摄入增加（＜0．01），呈剂量依赖方式，＜10－10mol／LET－1对MC无促增殖作用，ET－1≥10-10mol／L时，随着ET－1浓度增加。MC对3H－TdR摄人也增加；在1％小牛血清存在下，10-7mol／LET－1明显促进MC表达Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原mRNA，而10-12mol／LET－1无此作用。结论ET－1可通过刺激MC增殖和产生细胞外基质促进慢性肾小球疾病病程进展。     

阿托伐他汀对糖尿病肾病大鼠肾小球细胞增殖的影响及其意义

目的探讨阿托伐他汀对糖尿病肾病大鼠肾小球细胞增殖的影响及意义。方法将40只SD雌性大鼠随机分为四组:糖尿病肾病组(DN组)、预防组、治疗组、对照组,每组10只。DN组、预防组和治疗组糖尿病造模成功后,预防组和治疗组分别给予不同剂量的阿托伐他汀干预,对照组仅注射柠檬酸缓冲液。第8周测定相关生化指标,观察肾组织病理改变后,通过免疫组化法分析大鼠肾小球增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)的表达。结果预防组和治疗组相关生化指标较DN组好转,肾脏病变减轻,PCNA表达于肾小球固有细胞。DN组肾小球中PCNA的表达均较预防组、治疗组、对照组明显上调。而预防组、治疗组肾小球中PCNA的表达较DN组下调,且预防组PCNA的下调更为显著。结论阿托伐他汀通过下调肾小球PCNA表达,抑制肾小球细胞增殖实现对DN的保护作用。