肝细胞癌发生中丙型肝炎病毒NS3蛋白对诱导型一氧化氮合酶表达的影响

OBJECTIVE: To investigate hepatocarcinogenesis by detecting the effect of HCV NS3 protein on expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA in hepatocellular carcinoma (HCC) and pericarcinomatous liver tissues(PCLT). METHODS: The expression of HCV NS3 protein and iNOSmRNA was detected by immunohistochemical technique (SP method) and in situ hybridization in specimens of HCC and PCLT from 52 patients with HBV(-). The relationship between the positive rate and the signal strength was tested statistically. RESULTS: The positive rate of HCV NS3 protein in HCC was lower (46.2% vs. 67.3%), and signal strength was weaker than those in PCLT. The signal strength of HCV NS3 protein was correlated with the degree of carcinomatous cells differentiation in HCC (P < 0.01). The positive rates (80.8% and 90.4%) of iNOSmRNA in HCC and PCLT had no statistical difference. Signal intensity of iNOSmRNA in HCC was weaker than that in PCLT. The higher HCVNS3 protein expression level was, the stronger iNOSmRNA signals in PCLT (P < 0.01). In particular, the localization and patterns of HCV NS3 protein were much similar to those of iNOSmRNA in the PCLT of some patients. CONCLUSIONS: HCV NS3 protein may exert its hepatocarcinogenic effect in the early stage on host cells by increasing product of nitric oxide, which may bring about transformation of hepatocytes.     

肝细胞癌发生中丙型肝炎病毒NS3蛋白对诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的 :研究肝细胞癌 (HCC)及其癌旁肝组织 (PCLT)中丙型肝炎病毒 (HCV)NS3 蛋白对诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)mRNA表达的影响 ,以探讨其在HCC发生中的作用。方法 :利用SP免疫组化和原位杂交技术检测 5 2例HBV(- )的HCC及其PCLT中HCVNS3 蛋白和iNOSmRNA的表达 ,并比较两者的相关性。结果 :HCC中HCVNS3 蛋白的阳性率 (4 6 .2 % )和信号强度明显低于PCLT(6 7.3% ) ,且其表达强度与癌细胞分化程度相关 (P <0 .0 1) ;iNOSmRNA的阳性率 (80 .8% )与PCLT中者无差别 (90 .4% ,P <0 .0 1) ,但其阳性信号强度明显低于PCLT(P <0 .0 5 )。PCLT中HCVNS3 蛋白表达愈高iNOSmRNA的信号强度愈强 (P <0 .0 1) ,特别是在有些病例中两者的定位和信号形态几乎一致。结论 :HCVNS3 蛋白可能在肝细胞转化早期通过作用于iNOS基因促进NO生成导致肝细胞癌变     

肝细胞癌发生中丙型肝炎病毒NS3蛋白对诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的研究肝细胞癌（HCC）及其癌旁肝组织（PCLT）中丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响,以探讨其在HCC发生中的作用。方法利用SP免疫组化和原位杂交技术检测52例HBV（-）的HCC及其PCLT中HCVNS3蛋白和iNOSmRNA的表达,并比较两者的相关性。结果HCC中HCVNS3蛋白的阳性率（46.2%）和信号强度明显低于PCLT（67.3%）,且其表达强度与癌细胞分化程度相关（P<0.01）;iNOSmRNA的阳性率（80.8%）与PCLT中者无差别（90.4%,P<0.01）,但其阳性信号强度明显低于PCLT（P<0.05）。PCLT中HCVNS3蛋白表达愈高iNOSmRNA的信号强度愈强（P<0.01）,特别是在有些病例中两者的定位和信号形态几乎一致。结论HCVNS3蛋白可能在肝细胞转化早期通过作用于iNOS基因促进NO生成导致肝细胞癌变。     

肝细胞癌组织中P16蛋白表达与丙型肝炎病毒感染的关系

目的：研究肝细胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ,ＨＣＣ）组织中Ｐ１６蛋白表达与丙型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）感染的关系。方法：用免疫组化ＡＢＣ法检测４６例ＨＣＣ及其癌旁肝组织中Ｐ１６蛋白和ＨＣＶ抗原的表达。结果：Ｐ１６蛋白的阴性表达率在ＨＣＣ癌组织（５８．７％,２７／４６）明显高于其癌旁组织（３６．８％,１４／３８）（Ｐ〈０．０５）,在Ｅｄｍｏｎｄｓ     

肝细胞癌组织中HBVM和P53蛋白的表达及其相关性

目的检测肝细胞癌组织中HBV的感染与P53表达的相关性。方法102例手术切除的肝细胞癌的石蜡包埋标本,连续切片,用免疫组织化学SP法检测HBVM和P53蛋白。结果病理诊断102例肝细胞癌组织中．免疫组化检测HBVM( )74例(72．55％);P53( )57例(55．88％);HBVM( )、P53( )54例(52．94％);HBVM( )、P53(-)20例(19．61％);HBVM(-)、P53( )3例(2．94％);HBVM(-)、P53(-)25例(24．51％)。癌组织中HBVM( )、P53( )与其他三者比较,差异非常显著(P＜0．01)。结论HBVM表达阳性的肝细胞癌组织中P53表达阳性率高。     

Bcl-2 和p53 蛋白表达对肝硬变和肝细胞癌中细胞增殖和凋亡的调节

利用原位 Ｄ Ｎ Ａ 末端转移酶标记技术及 Ｓ Ｐ 免疫组织化学方法检测了肝硬变和肝细胞癌（ Ｈ Ｃ Ｃ）组织中凋亡细胞,ｐ５３ , ｂｃｌ２ 蛋白和 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 的表达。结果显示： Ｈ Ｃ Ｃ 与肝硬变组织比较,凋亡细胞密度低, Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 阳性细胞密度高,ｐ５３ 和 ｂｃｌ２ 蛋白阳性强度高,且均与 Ｈ Ｃ Ｃ 分化程度有关。提示ｐ５３ 和 ｂｃｌ２ 蛋白可能是通过其过度表达影响细胞增殖和细胞凋亡失衡,并以“选择性细胞增殖”形式导致 Ｈ Ｃ Ｃ 的发生和发展。     

宫颈癌组织中P53蛋白过度表达的检测

应用免疫组织化学技术对１４例正常宫颈、２０例宫颈良性病变、４１例宫颈癌组织标本进行Ｐ５３蛋白过度表达的检测,以了解其与宫颈癌发生的关系。结果正常宫颈和宫颈良性病变中均无Ｐ５３蛋白过度表达,宫颈癌中Ｐ５３蛋白过度表达阳性率为２６８％,表明Ｐ５３蛋白过度表达可能与宫颈癌的发生有关（Ｐ＜００５）,其在宫颈癌中表达阳性率不高,表明宫颈癌的发生是多因素共同作用的结果。     

肝细胞癌HBVDNA和癌基因表达的分子病理研究

目的：从分子水平观察肝细胞癌组织ＨＢＶＤＮＡ和癌基因的表达情况及与发病的关系。方法：应用原位核酸分子杂交技术研究４５例原发性肝细胞癌和２５例肝硬化的石蜡切片组织中ＨＢＶＤＮＡ和ｎ－ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ癌基因表达情况。结果：在肝细胞癌中见有ｎ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ表达增强，其检出率分别为６８．９％（３１／４５）和４０．０％（１８／４５），高于肝硬化组（２８．０％，８．０％）（Ｐ＜０．０５）。４０％肝细胞癌病例（１８／４５）两种癌基因同时过量表达，４５例肝细胞癌组织中有１９例存在有ＨＢＶＤＮＡ序列（４２．２％）并均具有ｎ－ｒａｓ或ｃ－ｍｙｃ过度表达。结论：两种癌基因ＨＢＶＤＮＡ可能有激活癌基因作用，肝细胞癌发生中可能起着重要的协同作用。ＨＢＶ感染与肝细胞癌发生有密切关系。     

人肝细胞癌P53蛋白免疫组化研究

目的：探讨Ｐ５３基因突变与肝细胞癌（ＨＣＣ）发生发展的关系。方法：应用敏感的免疫组化方法检测８０例人原发性肝癌及其癌旁组织（包括正常肝组织、肝硬化组织及不典型增生肝组织）基因蛋白的表达。结果：８０便肝癌组织中３５例Ｐ５３蛋白阳性，阳性反应产物主要们于细胞核，其对应癌旁组织未见Ｐ５３蛋白的表达。Ｐ５３蛋白的阳性表达与肝癌的转移显著相关，但与肿瘤大小及分化程度无关。结论：结果表明Ｐ５３蛋白过度表达不一     

肝细胞癌HBVDNA和癌基因表达的分子病理研究

从分子水平观察肝细胞癌ＨＢＶＤＮＡ和癌基因的表达情况及发病的关系。应用原位核酸分子杂交技术研究４５例原发性肝细胞癌和２５例肝硬化和石蜡切片组织中ＨＢＶＤＮＡ和ｎ－ｒａｓ，ｃ－ｍｙｃ癌基因表达情况。     

肝细胞癌变过程中P53的突变和甲胎蛋白的表达

对４例正常人肝、５例肝硬变、５例肝腺瘤样增生（ＡＨ）、１６例肝细胞癌（ＨＣＣ）（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级各４、６、６例）组织中突变型Ｐ５３蛋白（ｍＰ５３）和甲胎蛋白（ＡＦＰ）进行了免疫组化检测。结果发现：正常人肝ｍＰ５３、ＡＦＰ均阴性。５例肝硬变组织中，４例同时显示ｍＰ５３和ＡＦＰ阳性，１例显示二者皆阴性。５例ＡＨ中，４例为ｍＰ５３、ＡＦＰ阳性，１例为二者阴性。在１６例ＨＣＣ中，４例Ⅰ级     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体,并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板,通过PCR反应扩增4 目的基因片段,采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连,转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞,通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达,免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒,经测序其与NCBI 公布的序列完全一致,并可在U2OS 细胞中表达,DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%,对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体,并可在U2OS 细胞中表达,诱导细胞凋亡。     

青少年原发性肝癌与乙型及丙型肝炎病毒感染的关系分析

目的研究我院收治的青少年原发性肝癌(PHC)患者乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV/HCV混合感染率,为采取有效的防治措施提供科学依据。方法收集2001年1月—2011年10月解放军302医院收治的青少年PHC患者为病例组,同期住院的其他肝病患者为对照组,对HBV、HCV、HBV/HCV血清标志物阳性率情况进行分析。结果病例组HBsAg、抗HBe、HBeAg、HBV-DNA阳性率分别为77.5%、55.0%、17.5%和40.0%,均高于对照组(25.0%、20.0%、5.0%和7.5%);抗HCV和HCV-RNA阳性率分别为12.5%和15.0%,HBV/HCV混合感染率为12.5%,均高于对照组(5.0%、2.5%和2.5%)。结论 HBV感染、HBV/HCV混合感染对青少年PHC患者的发病具有一定作用,但HBV感染仍是主要的因素。     

丙型肝炎抗原在肝炎、肝癌组织中的表达

肝细胞癌手术标本３０例及肝炎肝穿刺标本１５例，作丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）免疫组化研究。第一抗体为ＨＣＶ核心抗原单克隆抗体；检测系统为ＡＢＰＡＰ法。结果肝癌组５例（１７％）、肝炎组３例（２０％）阳性；总阳性率１８％。阳性信号为散在性，胞浆型。肝癌组阳性的５例均见癌旁组织阳性，其中３例同时有散在性癌细胞表达。     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

丙肝病毒NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体的构建

目的通过克隆丙肝病毒非结构蛋白NS3-4A基因,构建表达HCV-NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体。方法设计合成HCV NS3-4A基因全长的特异性引物,应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增非结构蛋白区NS3-4A基因片段,经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后克隆到pFastbacDual上,并转化到大肠杆菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到的基因片段长度为2.2kb,该片段成功克隆在杆状病毒穿梭载体pFastBacDual上,经测序证实为HCV NS3-4A基因,这表明HCV-NS3A基因重组杆状病毒穿梭载体构建成功。结论成功构建了表达HCV NS3-4A基因的杆状病毒穿梭载体,这将为下一步HCV杆状病毒载体疫苗的制备打下基础。     

胃肠恶性肿瘤及其切缘组织中p53基因突变和p53蛋白表达

目的 探讨胃肠道恶性肿瘤及其切缘组织中p53基因突变和p53蛋白表达与手术切缘的安全性关系。方法 用PCR－SSCP和免疫组化S－P方法检测20例胃癌和10例大肠癌标本和切缘组织中p53基因突变和p53蛋白表达情况。结果 （1）胃肠道恶性肿瘤组织中有很高的p53基因突变率（63％）和p53蛋白阳性表达率（53．33％）。（2）肿瘤组织中p53蛋白表达是切缘组织中p53蛋白表达的前提。（3）p53基因突变和p53蛋白表达随肿瘤切缘距离的增加而呈现极显著的递减趋势。结论 就p53基因突变和p53蛋白表达而言,距离肿瘤边缘5cm可定为肿瘤的分子切缘。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达的研究

目的:研究乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达,探讨Foxp3在乙肝相关性肝癌发病中的意义。方法:使用real time RT-PCR检测34例肝癌组织中Foxp3mRNA的水平,通过焦磷酸测序的方法检测Foxp3的甲基化水平。结果:HBV阳性肝癌组织中Foxp3mRNA表达水平高于HBV阴性组,具有显著差异;HBV阳性与阴性肝癌组织中Foxp3的甲基化水平不具有统计学差异。结论:原发性肝癌患者中HBV感染使Foxp3mRNA表达升高,Foxp3mRNA表达升高可能不是或不完全是通过甲基化修饰来调控的。