人TRAIL分子胞外区的纯化及活性检测

目的：利用大肠杆菌表达hTRAIL41-281蛋白，并纯化复性成生物活性形式。方法：以IPTG诱导表达，使用Ni-NTA层析柱分离纯化蛋白，透析法复性，SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定，DNA断裂实验检测hTRAIL41-281蛋白的凋亡诱导活性。结果：表达的蛋白以包涵体的形式存在，纯化后得到分子量为30.5kD、纯度在90％以上的蛋白，Western blot证实为hTRARIL41-281分子。经复性，DNA断裂实验检测出该蛋白有较好的诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论：成功地利用大肠杆菌表达、Ni—NTA层析柱分离纯化、透析法复性hTRAIL41-281蛋白，并证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。     

抗人CD33单链抗体的基因构建、表达及其生物活性检测

目的：构建及表达抗人CD33单链抗体（抗CD33-scFv）基因，并检测其生物活性。方法：采用RT—PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因，再通过重叠延伸拼接（splice—overlap extension）PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽（Gly4Ser）3，体外构建抗人CD33-scFv基因。将其克隆至原核表达载体PET-28a（＋）并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达。结果：SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，抗CD33-scFv在Rosetta（DE3）菌中获得高效表达，重组蛋白的相对分子质量（Mr）为30000，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，镍柱亲和层析纯化和体外复性过程，获得了高纯度的scFv片段。流式细胞术（FCM）分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合，保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性。结论：重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功，并且通过复性得到有生物活性的scFv，为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。     

生物工程技术制备人源抗-HBs Fab 片段

目的：用生物工程技术制备人源性抗-HBsFab。方法：将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBsFab基因克隆入pBAD/gⅢA载体，进而转化Tpo10大肠杆菌，对重组质粒菌发酵表达后，利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab蛋白。对所得包涵体依次变性，溶解，纯化后，利用透析进行复性，用Western blot检测Fab蛋白的特异性，Dot blot测定其生物学活性。结果：经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白，有较好的生物学活性，并且总量达到80mg/L。对所获包涵体进行透析复性后，也可得到少量有活性的蛋白，但比例很小。结论；用pBAD/gⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBsFab片段，发酵培养后，经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白。为人源抗-HBsFab片段的大量制备提供了有效手段。     

封闭N-cadherin解整合素金属蛋白酶水解位点的单链抗体的制备及鉴定

目的 制备封闭神经型钙黏素(N-cadherin)解整合素金属蛋白酶水解位点(ADAM)的单链抗体(scFv),并进行鉴定.方法 首先利用RT-PCR技术从分泌抗N-cadherin的ADAM水解位点单克隆抗体(mAb)细胞株中扩增出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,然后通过重叠延伸PCR法(SOE-PCR),构建成scFv基因片段.再将其克隆入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达,通过镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot法等测定重组蛋白的生物学活性.结果 PCR、酶切和测序表明scFv片段长744 bp,编码248个氨基酸.scFv基因表达载体转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达出相对分子质量(Mr)约29 000的目的蛋白,主要为包涵体形式,经变性,纯化和复性后,获得纯度达90％以上的scFv蛋白,ELISA和Western blot法检测表明可溶性scFv可以与N-cadherin的ADAM水解位点序列多抗原短肽和全长N-cadherin结合.结论 成功构建并表达封闭N-cadherin的ADAM加工位点单链抗体.     

临床分离2型登革病毒突变株E蛋白N端158氨基酸基序免疫原性初探

目的:Ⅱ型登革病毒临床分离突变株(B株)E基因区部分序列的原核表达载体构建,蛋白表达、复性和纯化,及其免疫原性的初探。方法:将B株E基因1～476bp序列克隆入原核表达载体pET28a(+),经酶切、测序鉴定正确后转入表达菌,IPTG诱导后将包涵体变性,复性,纯化后的蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot和ELISA进行抗体鉴定。结果:成功构建了pET28a(+)-B-E原核表达载体,在表达菌中以包涵体形式稳定高表达,分子量为20kD。利用蛋白的His标签进行Western blot鉴定确定该蛋白为重组B-E蛋白,得到的可溶蛋白纯度大于90%。B-E蛋白免疫BALB/c和C57BL/6小鼠均可以得到有效的多克隆抗体。结论:B-E蛋白对BALB/c和C57BL/6小鼠具有免疫原性,其中ELISA鉴定免疫C57BL/6小鼠抗体的滴度为1∶12800,Western blot鉴定免疫BALB/c小鼠抗体滴度为1∶500。     

人抗HER2单链抗体/精氨酸九聚体融合蛋白的基因构建、表达及鉴定

目的:构建人源性抗HER2单链抗体(scFv)/精氨酸九聚体(9R)融合蛋白基因,在大肠杆菌里表达纯化并检测该融合蛋白的活性。方法:采用PCR的方法,扩增融合基因scFv-9R,将获得的基因克隆入原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,通过Ni-NTA螯合层析纯化,透析复性,超滤浓缩。ELISA分析scFv-9R融合蛋白抗原亲和活性,凝胶迁移实验检测scFv-9R融合蛋白与siRNA结合活性。结果:成功构建了人源性抗HER2 scFv-9R融合基因,经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达。表达的目的蛋白scFv-9R能与HER2抗原结合,同时具有siRNA结合能力。结论:scFv-9R具有结合抗原与siRNA双重活性,为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。     

重组人源抗HBsAg单链抗体的纯化及亲和常数测定

目的:对融合6×His标签的人源抗乙型肝炎表面抗原单链抗体的包涵体进行纯化和复性, 并对复性产物的抗原结合性质进行鉴定。方法:工程菌表达的包涵体裂解后, 金属螯合亲合层析纯化, 然后以尿素透析、盐酸胍透析和金属螯合亲和层析柱原位复性3种方法进行复性;复性产物以免疫亲和层析精制, 非竞争酶免疫法测定亲和常数结果:盐酸胍透析复性产物的比活性最高, 蛋白回收率为(61.08±1.45)%;精制后的重组单链抗体的亲和常数为(2.30±0.32)×10⁷L/mol.结论:本株单链抗体可以应用优化的透析复性技术, 在体外高效复性, 其抗原结合性质不受N末端纯化标签的影响。     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv／鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究

目的探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体／小鼠热休克蛋白70（6811ScFv／mHSP70）融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其最佳体外复性条件。方法大肠杆菌表达大量融合蛋白6811ScFv／mHSP70：①比较不同的裂解液（8mol／L尿素和6mol／L盐酸胍）对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度L-精氨酸对蛋白稀释复性的影响;③比较稀释复性和柱。卜复性对融合蛋白复性效率及活性的影响。采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度。所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法。结果以包涵体形式表达6811ScFv／mHSP70蛋白：①经6mol／L盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8mol/L尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6mol／L盐酸胍彻底裂解的包涵体经8mol／L尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0．5mol／L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSH）浓度比为1：5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低。结论本研究建立了6811ScFv／mHSP70融合蛋白的最佳复性条件：包涵体经6mol／L盐酸胍彻底裂解后,再经8mol／L尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0．5mol／L L-精氨酸和GSH：GSSH=1：5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

重组胶质细胞生长因子2蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达的方法得到胶质细胞生长因子2(GGF2)重组蛋白。方法将不含信号肽编码序列的GGF2基因用亚克隆的方法自PVT-GGF2质粒克隆至PCXJ18质粒,再由PCXJ18-GGF2质粒克隆至pET-32b(+)质粒,构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。表达载体转染4种宿主菌,筛选合适者。优化表达时程和IPTG诱导剂量。GGF2大量表达后回收包涵体,复性。复性产物利用His Bind树脂进一步纯化。纯化产物用Western blot鉴定。结果测序鉴定表明,成功构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。筛选结果表明Origami B(DE3)为合适宿主菌。适宜的表达条件为30℃诱导前扩增,浓度25μmol/L IPTG,37℃诱导2 h。所表达外源蛋白相对分子质量和预期一致。回收、纯化后得到纯度约为96%的产物。Western blot鉴定表明所获为GGF2重组蛋白。结论原核表达方法得到足量GGF2重组蛋白。     

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

抗果蝇Dnop5蛋白抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备兔抗果蝇Dnop5蛋白的抗体,并进行特性鉴定。方法:以RTPCR扩增Dnop5的全长cDNA并克隆入pET28a( )表达载体中,表达并纯化Dnop5His融合蛋白。用纯化的Dnop5His融合蛋白免疫家兔,制备抗Dnop5的抗体,并用His亲和层析法进行纯化。采用Westernblot法和免疫组化染色法鉴定该抗体的特异性及生物学活性。结果:表达的Dnop5His蛋白以包涵体的形式存在,用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的Dnop5His融合蛋白,以纯化的Dnop5His免疫家兔制备的兔抗Dnop5的抗体,经Westernblot分析显示:该抗体可与果蝇的胚胎、幼虫、蛹及成虫组织中表达的Dnop5特异性结合。结论:获得具有良好特异性的兔抗dnop5抗体,为进一步研究Dnop5的功能奠定了基础。     

DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物经NiNTA亲和层析柱纯化后,用SDSPAGE进行鉴定。以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔,制备兔抗PBP抗体。抗体的效价及特异性用Westernblot进行测定和分析。结果:扩增和克隆出了720bp的PBP基因。构建的重组质粒pET28aPBP在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中,纯化的PBP经SDSPAGE鉴定呈单一条带。以纯化的PBP免疫兔,制备了兔抗PBP抗体。Westernblot鉴定证实,该抗体可与原核表达的PBP特异性结合,抗体效价为1∶1600。结论:在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP,并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体,为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础。     

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。     

人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素（MBL）糖识别域（CRD）。方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEM-mbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白。分别以Western blot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性。结果PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX-4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1-CRD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GST-CRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白。纯化的GST-CRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性。结论获得了具生物学活性的人MBL CRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料。     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

抗KDR单链抗体的构建、表达及生物学活性鉴定

目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 设计合成抗KDR单抗 (mAb)Ycom1D3VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接 (splicingoverlapextensive, SOE)PCR, 在VH 和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗KDRscFv基因并进行序列分析。将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性。结果: 序列分析表明, 抗KDRscFv基因的全长为 729bp, 编码 243个氨基酸。将重组体表达产物进行SDS PAGE及Westernblot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为 30 000, 同预期的结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的 20%。表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达 90%以上。ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性KDR抗原及表达KDR受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性。结论: 成功地构建了抗KDRscFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

野生型及突变型人白细胞介素13的原核表达及活性分析

目的:在大肠杆菌中表达野生型和突变型重组人IL13,经纯化复性获得具有有活性的蛋白。方法:用PCR扩增IL13基因片段,用定点突变PCR获得其突变体(IL13’)基因。将IL13和IL13’基因分别克隆至原核表达载体pET30a( )中,构建重组体pET30a( )IL13和pET30a( )IL13’,分别命名为pETIL13和pETIL13’。以重组体转化E.coliBL21(DE3)在IPTG诱导下进行表达。表达产物用NiNTA层析柱进行纯化。纯化产物用氧化还原谷胱甘肽系统透析复性后,检测其生物学活性。结果:在E.coliBL21(DE3)中表达了IL13/IL13’His6融合蛋白。经SDSPAGE显示,融合蛋白的Mr约17000,经Westernblot证实为人IL13。表达的融合蛋白以包涵体的形式存在,纯化后得到较高纯度的重组蛋白。复性后的包涵体检测具有生物学活性。结论:成功地获得具有生物学活性的野生型和突变型人IL13重组蛋白,为下一步研究奠定了基础。     

抗B7-H4-scFv / PE38KDEL 重组免疫毒素的表达和功能性检测

目的:构建基于抗B7-H4 单链抗体(scFv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR )技术将anti-B7-H4-scFv 基因和毒素PE38KDEL 基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot 鉴定;间接ELISA 和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT 法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4 单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。