Survivin启动子的克隆及其在膀胱癌细胞BIU87中的活性鉴定

目的克隆Survivin启动子的有效片段,并检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的转录活性。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3BSurvivin重组质粒,用脂质体法瞬时转染BIU87及SV-HUC-1中,检测Survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3BCMV重组质粒作为阳性对照。48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体,转染BIU87细胞后的荧光素酶活性为2 286.98±440.21,而SV-HUC-1荧光素酶活性为12.32±1.16,两者差异有统计学意义（〈0.01）。结论本实验成功克隆的Survivin启动子在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,其有可能作为调控元件用于膀胱癌的靶向性基因治疗。     

survivin启动子的克隆及其在前列腺癌细胞系中的活性鉴定

目的克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法PCR方法扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro,克隆入pGL3-Basic,分别构建重组质粒pGL3-S1pro和pGL3-S2pro,脂质体转染前列腺癌细胞和Changliver肝细胞,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,其中S2pro活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的三分之一。结论survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定

目的：构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法：用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3—Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果：构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3—Control中增加了2．7万倍。结论：成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3—pac。     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响。方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到ADAM33基因启动子区1 953 bp片段。通过双酶切、连接、转化等步骤将该片段克隆至pGL3-Basic载体构建ADAM33启动子重组质粒,并将其转染至人HEK293T、BEAS-2B细胞中;利用双荧光素酶报告基因技术检测HEK293T、BEAS-2B细胞中所构建的质粒启动子活性。将HEK293T、BEAS-2B细胞分为pcDNA-GATA3组和pcDNA3.1对照组,分别转染GATA3过表达质粒和空白对照质粒,用双荧光素酶报告基因技术检测荧光素酶活性;用实时荧光定量PCR检测BEAS-2B细胞中ADAM33 mRNA相对表达水平。结果:通过PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建含ADAM33启动子片段的重组质粒;重组质粒的ADAM33启动子活性较pGL3-Basic对照组...     

人Tim-3启动子的克隆及其真核报告质粒的构建

目的克隆人Tim-3基因5′端非编码区处具有启动子活性的片段，构建其真核报告质粒，为进一步研究Tim-3表达调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板，针对人Tim-3启动子5′端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898～+242片段，设计特异性引物，PCR扩增该片段，命名为Tim-3P2，经双酶切后克隆入pGL3-Basic载体SacⅠ、XhoⅠ位点，构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒，与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系，通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果pGL3-Tim-3P2经PCR、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误；pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞（两种细胞均可表达内源性Tim-3）24h和48h，双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍；而pGL3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性。结论成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒，该载体具有特异性Tim-3启动子活性，为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础。     

PEPCK启动子调控的报告基因表达质粒的构建

目的构建磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控的报告基因表达质粒,为评价PEPCK启动子对下游基因的转录调节创造条件.方法从载体质粒pPEPCK-int中截取大小为550 bp的大鼠PEPCK启动子片段,借助过渡载体质粒PBS-PEPCK,将PEPCK启动子片段插入pGL2-Basic-Luc报告质粒.结果通过酶切鉴定及基因测序,证明pGL2-PEPCK-Luc荧光素酶表达质粒构建成功,并能够在体外表达荧光素酶.结论 pGL2-PEPCK-Luc质粒可作为体外研究PEPCK启动子转录调节的新手段.     

生存素在胃癌细胞中的表达及IL-1β对其表达的影响

目的探讨生存素在人正常胃黏膜细胞株及胃癌细胞株中的表达和白细胞介素（IL）-1β对胃黏膜细胞生存素表达的影响。方法用RT-PCR和Westernblot法检测人正常胃黏膜细胞株（GES-1）及3株胃癌细胞（AGS、SGC-7901、BCG-823）和经IL-1β处理后的GES-1、AGS细胞中生存素的表达。结果 3株胃癌细胞均有生存素表达,正常胃黏膜细胞无生存素表达。IL-1β不刺激正常胃黏膜细胞生存素的表达,可剂量依赖性增加胃癌细胞生存素的表达。结论胃癌细胞均有生存素表达,正常胃黏膜细胞不表达生存素;IL-1β对胃癌细胞生存素的表达有正向作用,表明IL-1β在胃癌的发展过程中有一定作用。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

二甲双胍和LPS通过转录因子RUNX2调控NFATc2基因的转录

目的 构建人T细胞活化核因子C2（NFATc2）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法 利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果 研究成功构建了不同片段长度（2170、2077、1802、1651、1083、323 bp）的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍（1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850）。中浓度（5 mmol/L）和高浓度（10 mmol/L）的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍（1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321）。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍（1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321）。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降（2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786）。结论 pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。     

肺动脉高压患者Ⅱ型骨形成蛋白受体基因启动子-142G>A突变的研究

目的 探讨Ⅱ型骨形成蛋白受体(BMPR2)基因启动子突变与肺动脉高压发病的关系.方法 对1例家族性肺动脉高压(FPAH)、19例特发性肺动脉高压(IPAH)患者和50名健康成人进行BMPR2基因启动子区转录起始点上游-2022 bp的DNA序列测定.分别将突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段插入pGL3-basic双荧光素酶报告基因载体中,获得pGL3-BMPR2启动子-突变型重组质粒和pGL3-BMPR2启动子-野生型重组质粒.以2种重组质粒分别转染人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)和人肺动脉内皮细胞(HPAEC),用Veritas微孔板发光检测仪检测突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段在2种细胞中的转录调控活性(结果以萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性比值表示).应用MAPPER软件分析突变型和野生型BMPR2基因启动子区转录因子结合位点.结果 在1例36岁女性FPAH患者的BMPR2基因启动子区发现杂合子突变-142G>A.突变型BMPR2基因启动子片段在HPASMC和HPAEC中的转录活性(分别为9.58±3.85、59.07±25.54)均明显低于野生型(分别为16.80±3.55、115.58±38.02,均P<0.05),而且缺失转录因子Sp3结合位点.结论 BMPR2基因启动子-142G>A突变可能与FPAH发病有关.     

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的：构建含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法：利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3／MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3／MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果：构建了含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论：重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。     

Abl相互作用蛋白1过表达对胃癌细胞系AGS体外增殖的影响

目的 明确Abl相互作用蛋白1(ABI1)在正常胃黏膜细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS中的表达模式,并探讨ABI1过表达对AGS细胞体外增殖的影响.方法 首先用免疫组化、免疫荧光、逆转录(RT)-PCR、实时定量PCR及Western印迹法明确ABI1在GES-1及AGS细胞中的表达模式;其次用脂质体转染方法分别将基因重组表达载体鼠干细胞病毒(MSCV)-绿色荧光蛋白(GFP)-ABI1质粒和对照载体MSCV-GFP质粒导入AGS细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达MSCV-GFP-ABI1和MSCV-GFP的细胞系,用实时定量PCR和Western印迹法鉴定是否成功构建了ABI1过表达的细胞模型;最后用细胞活力检测试剂盒[八肽胆囊收缩素(CCK-8)]检测ABI1过表达对细胞增殖的影响.结果 ABI1在正常胃黏膜细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS中均有表达;与GES-1细胞相比,ABI1在AGS细胞中的表达从mRNA水平到蛋白质水平均下调;成功构建稳定表达MSCV-GFP-ABI1的AGS-MSCV-GFP-ABI1细胞模型,AGS-MSCV-GFP-ABI1细胞中ABI1的表达无论mRNA水平还是蛋白质水平均明显高于AGS细胞(均P=0.002);CCK-8法检测显示,AGS-MSCV-GFP-ABI1细胞在24、48、72、96 h 4个时间点增殖率分别为1.46±0.31、4.75±0.12、6.62±0.32、8.96±0.27,均明显低于AGS细胞及AGS-MSCV-GFP细胞(均P<0.01).结论 ABI1在胃癌细胞中表达下调,其过表达可以抑制人胃癌细胞系AGS的增殖,提示ABI1表达下调可能参与了胃癌的发生发展过程,而影响胃癌细胞的增殖可能是其发挥作用的重要途径之一.