离子交换色谱一步法纯化Ⅱ型胶原蛋白

类风湿性关节炎(RA)是常见的危害性和致残率极大的自身免疫性疾病。近年来的研究提示80％～90％均为Ⅱ型胶原的软骨胶原蛋白所诱发的自身免疫可能是RA发病的重要因素之一。在口服耐受对动物关节炎模型治疗作用的研究中发现,口服Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)可使动物关节炎症明显减轻,病程缩短。国外已有学者将用鸡肋软骨提纯的CⅡ用于活动期RA患者的治疗,并取得了较好疗效[1]。由于鸡肋软骨来源较少,我们以牛软骨为原料,采用酶消化法[2]提取了CⅡ,并 对其进行了纯化和鉴定。     

乌梢蛇Ⅱ型胶原提取及其诱导大鼠关节炎特性的研究

提取和纯化乌梢蛇Ⅱ型胶原,观察乌梢蛇Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎的特性,为研究乌梢蛇治疗类风湿关节炎的机制提供研究方向。离心提取乌梢蛇Ⅱ型胶原,经DEAE-52纤维素交换柱纯化,斑点免疫渗滤试验和免疫印迹试验进行成分鉴定。乌梢蛇Ⅱ型胶原不完全佐剂免疫大鼠,观察大鼠关节炎发生情况、抗Ⅱ型胶原抗体、CD 4/CD8亚群、血清中TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-4的变化。乌梢蛇Ⅱ型胶原提纯品在SDS-PAGE凝胶电泳上呈一条区带,斑点免疫渗滤试验和免疫印迹试验为阳性反应。诱导大鼠关节炎发生率为86.67%,关节炎大鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体明显增高(P<0.01),CD4 T细胞亚群和CD4~+/CD8~+增高(P<0.05),TNF-α含量增加(P<0.01),IL-10含量降低(P<0.01),血清中IL-1β和IL-4含量无变化。结果显示,乌梢蛇Ⅱ型胶原能通过免疫方法可以诱导大鼠产生多关节炎,并且体内有自身免疫反应的表现。     

肺泡Ⅱ型细胞的分离与纯化

分离与纯化肺泡Ⅱ型细胞,可广泛用于肺的病理生理,生物化学和分子主物学的深入研究.本文介绍了经肺循环灌洗和支气管灌洗后,再用弹性蛋白酶消化,lgG纯化肺泡Ⅱ型细胞的方法,采用这种方法,可从一只体重100～120g的健康Wistar大鼠获得肺泡Ⅱ型细胞2O×10~6个,存活率为90～95%.     

高纯度猪软骨Ⅱ型胶原的制备与检测

探讨以猪透明软骨为原材料制备高纯度Ⅱ型胶原的方法,为批量化生产提供依据。以猪透明软骨为原料,采用盐酸胍抽提蛋白多糖,酸性条件下酶解,中间过程经多步纯化去除杂胶原、降解及变性产物,最后经Sepharose H.P.阴离子柱层析纯化制备出产品并以Sigma公司产品作对照。SDS－PAGE电泳、氨基酸成份分析和紫外最大吸收光谱的结果表明,所提取的Ⅱ型胶原性质符合文献报导,纯度比Sigma公司的产品高。所提取的Ⅱ型胶原为高纯度的Ⅱ型胶原,由于采用肉用猪作原料,来源丰富,成本低,适合批量化的产品开发。     

猪软骨Ⅱ型胶原的制备及理化性能分析

目的建立一套完善的提取、纯化、检测Ⅱ型胶原的生产系统,供临床和科研应用.方法选取新鲜的猪透明软骨,经盐酸胍、胃蛋白酶等多步抽提,以及DEAE纤维素的柱层析,制备出高纯度的Ⅱ型胶原.结果通过SDS-PAGE电泳、氨基酸成分分析及羟脯氨酸的测定、紫外最大吸收光谱、电镜检测证实本法所制备的Ⅱ型胶原比Sigma(9007-34-5)公司的产品纯度高.结论用此方法制备的Ⅱ型胶原,材料来源广泛,程序简便,产品纯度高,易于大批量生产.     

重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的表达及活性研究

目的　表达、分离、纯化重组人Ⅱ型胶原 2 5 0 2 70多肽 (recombinanthumancollagentypeⅡpeptide 2 5 0 2 70 ,rhCⅡ 2 5 0 2 70 )并研究其对类风湿关节炎 (rheumatoidarthritis ,RA)患者外周血单个核细胞 (PBMC)和关节滑液单个核细胞 (SFMC)中特异性T细胞的活化作用。方法　利用DNA合成、聚合酶链式反应、重组DNA等基因工程的方法构建含有人Ⅱ型胶原功能性多肽CⅡ 2 5 0 2 70多聚基因的表达载体pGEX 4T 1,转化E .coliBL2 1,融合表达目的蛋白 ,经GlutathioneSepharose○R4B亲和层析柱分离纯化 ,12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和凝胶薄层扫描测量其相对分子质量 (Mr)和纯度。以不同浓度 (0 .1、1.0、10、10 0、10 0 0 μg/ml)的 6聚rhCⅡ 2 5 0 2 70和化学合成的CⅡ 2 5 0 2 70刺激体外培养的RA患者PBMC和SFMC ,等浓度的GST蛋白和PBS作为阴性对照 ,流式细胞仪测定刺激前后 2组培养细胞中T细胞CD6 9的表达率 ,以分析其对特异性T细胞的活化作用。结果　融合表达的目的产物经SDS PAGE分析 ,相对分子质量 (Mr)大小约为 43× 10 3,与预期相符。分离纯化的 6聚rhCⅡ 2 5 0 2 70经SDS PAGE凝胶薄层扫描 ,纯度为 89% ,浓度为 2 .1mg/ml。FACS分析 :经 10 0 μg/ml浓度的 6×rhCⅡ2 5 0 2 70刺激 3d     

类风湿性关节炎患者血清Ⅱ型胶原抗体的检测及意义

目的 探讨类风湿性关节炎（RA）患者血清抗Ⅱ型胶原（CⅡ)抗体阳性的意义。方法 分别以人Ⅱ型胶原蛋白（HCⅡ）及牛Ⅱ型胶原蛋白CⅡ（BCⅡ）作为包被抗原进行间接ELISA法，检测30例RA患者，对照组（30例非RA的风湿病患者和34例健康人）血清抗CⅡ抗体。结果 以HCⅡ及BCⅡ作为包被抗原检测RA患者血清抗CⅡ抗体的阳性率分别约为30．0％和33．3％；对照组血清中抗体阳性率均约为1．6％；二者差异极其显著（P＜0．01）。抗CⅡ抗体阳性的RA患者RF的阳性率高于抗CⅡ抗体阴性的RA患者。与HCⅡ和BCⅡ均发生阳性反应的血清8例，均为早期RA患者。结论 抗CⅡ抗体可作为判断RA患者病的辅助手段之一，牛CⅡ可替代人CⅡ进行有关RA发病机制中B细胞免疫的实验研究。     

类风湿性关节炎患者血清抗Ⅱ型胶原抗体的检测及意义

目的探讨类风湿性关节炎(RA)患者血清抗Ⅱ型胶原(CⅡ)抗体阳性的意义. 方法分别以人Ⅱ型胶原蛋白(HCⅡ)及牛Ⅱ型胶原蛋白CⅡ(BCⅡ)作为包被抗原进行间接 ELISA法,检测30例RA患者,对照组(30例非RA的风湿病患者和34例健康人)血清抗CⅡ抗体. 结果以HCⅡ及BCⅡ作为包被抗原检测RA患者血清抗CⅡ抗体的阳性率分别约为30.0%和33.3%;对照组血清中抗体阳性率均约为1.6%;二者差异极其显著(P＜0.01).抗CⅡ抗体阳性的RA患者RF的阳性率高于抗CⅡ抗体阴性的RA患者.与HCⅡ和BCⅡ均发生阳性反应的血清8例,均为早期RA患者. 结论抗CⅡ抗体可作为判断RA患者病情的辅助手段之一,牛CⅡ可替代人CⅡ进行有关RA发病机制中B细胞免疫的实验研究.     

刺激人γδ+T细胞增殖的结核杆菌多肽抗原的纯化与活性鉴定

目的：纯化可刺激人γδ^ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原。方法：采用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）S-100分子筛层析柱，对结核杆菌耐热抗原（Mtb-Ag)初步分离，将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原（Mtb-LW-Ag)洗脱峰，分别再经FPLCMonoQ离子交换层析柱进一步纯化，并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ^ T细胞增殖活性的测定。结果：Mtb-Ag经FPLCS-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰（B，C，D），Mr低的多肽峰分别糨MonoQ柱层析，鉴定出B峰含有6个主峰，C峰含有1个主峰，D峰含有8个主峰，对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测，发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ^ T细胞扩增。结论：利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽，而且其中的B-Ⅲ多肽的C-主肽可能是促进γδ^ T细胞活化增殖的主要多肽。     

重组人Ⅱ型胶原蛋白免疫原性多肽表达的研究

目的 构建编码人Ⅱ型胶原蛋白250-270多肽片段（HuCⅡ250-270)的多聚基因，以获得高效表达，高度可溶和便于纯化的重组多肽基因。方法 选用大肠杆菌（E.coli)偏爱密码子优化HuCⅡ250-270的基因组成，通过化学合成和PCR法，获得HuCⅡ250-270的基因，并利用BanHI和BglⅡ同裂酶进行酶切位点串联获得6聚体，对影响重组HuCⅡ250-270表达的各种因素进行系统研究，以获得优化表达的条件，对表达产物进行分离纯化。结果 酶切分析和DNA测序证实，6聚目的基因的构建正确，融合表达的量明显高于非融合表达，在优化条件下，可达30%，表达产物的可溶性明显提高（在90%以上），其相对分子质量（Mr)与预期的相符，纯化后的纯度达90%以上。结论 实现了HuCⅡ250-270的高效表达，为研究类风湿性关节炎的发病机制和治疗提供了实验依据。为在原核细胞中高效表达的胶原蛋白的功能性小片段，提供了可供参考的借鉴。     

Isolation of putative dengue virus receptor molecules by affinity chromatography using a recombinant E protein ligand

Nucleotide sequences coding for the full-length envelope (E) glycoprotein gene of dengue virus type 4 was amplified using an RT-PCR method from infected C6/36 cells and cloned into pPROEx-Hta expression vector. The expression of the recombinant E protein in Escherichia coli was confirmed by Western blot using a polyclonal anti-dengue polyclonal antibody. The His-tagged fusion protein was obtained from the bacterial cellular extracts in almost pure form by immobilized metal affinity chromatography and the recombinant protein retained its ability to bind to 40 and 45 kDa proteins, previously described as putative receptors for dengue virus in C6/36 cells. To purify the 40 and 45 kDa molecules, a total protein extract from C6/36 cells was passed through an affinity chromatography column using immobilized recombinant E protein. After washing with isotonic buffer, elution was accomplished using a high salt buffer. The two proteins obtained, with molecular weights of 40 and 45 kDa, were recognized by dengue 4 virus, in virus overlay protein binding assay. This procedure allows further characterization of molecules that could be involved in dengue binding and entry.     

抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用

目的 制备抗重组GST的单克隆抗体（mAb),并用来纯化重组GST融合蛋白,方法 用含重组GST融合蛋白基因的pGEX4T-1质粒转化E.coliBL21,IPTG诱导GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组GST融合蛋白,以此蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备mAb。将抗GSTmAb经ProteinA纯化后,与Sepharose4B偶联。结果 经3次亚克隆后,获得两株分泌抗GST载体特异性mAb的杂交瘤,采用该mAb对两种不同的GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定达到了商品化Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论 用抗GST蛋白特异性mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。     

生物素化抗细胞因子单克隆抗体的制备

目的 探讨生物素化单克隆抗体的制备方法。方法 应用经超滤、硫酸铵沉淀、ProteinG亲和层析纯化的来源于杂交瘤细胞培养上清中的大鼠抗小鼠IL-5、IL-4和IFN-γ单克隆抗体，以每mg抗体加入生物素制剂80ug室温反应60min，其反应液经SephadexG-25层析纯化，然后用生物素-亲和素ELISA法测定所制备的生物素化抗体活性。结果 该法制备的生物素化抗体活性高，用于检测感染巴西钩虫的IL-5转基因小鼠和非转基因小鼠的血清标本敏感性好。结论 该生物素化抗体的抗备方法具有制备简单、稳定性好等优点。     

重组汉滩病毒核蛋白的纯化及鉴定

目的：纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白。方法：重组菌经IPTG诱导后，表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶（GST）标签的融合蛋白，并以包涵体形式存在。将包涵体变性、复性后，采用Glutathione Sepharose 4B亲和色谱对核蛋白进行纯化，并用夹心ELISA和Western blot检测纯化蛋白。结果：表达产物第一次过柱亲和层析后可去除杂蛋白，获得纯化的核蛋白与谷胱甘肽转硫酶的融合蛋白，再经凝血酶酶切，第二次过柱亲和层析后获得的穿过峰为核蛋白，洗脱峰为GST。纯化的融合蛋白和纯化的核蛋白均为SDS－PAGE单点纯，并具有良好的抗原活性。结论：Glutathione Sepharose 4B亲和色谱纯化重组汉滩病毒核蛋白是一种较为有效的方法。     

经点突变的花生主要过敏原Ara h2低致敏原的制备与鉴定

目的构建经点突变的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性。方法将Ara h 2基因进行点突变,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的过敏原性。结果测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果均表明经点突变的Ara h 2蛋白(M-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论成功构建了经点突变的Ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原的潜能。     

截短ALT1蛋白的获得及其多克隆抗体的制备

 目的 原核表达、纯化截短ALT1蛋白,制备ALT1多克隆抗体。方法 利用pCold TF载体原核表达系统,IPTG诱导,表达经生物信息学分析含有两个编码ALT1抗原表位的ALT1 N端1~115个氨基酸序列的基因片段,依次经镍(Ni)离子亲和柱纯化、HRV 3C蛋白酶酶切、二次镍离子亲和柱纯化和分子筛柱层析得到不带标签的截短ALT1纯蛋白,用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果 经测序证实,成功构建了截短pCold TF-ALT1表达载体。获得纯度达90%的不带标签的截短ALT1重组蛋白,制备了效价达4.0×106的ALT1多克隆抗体,经western blot鉴定,能特异性地识别ALT1抗原和肝细胞裂解液。结论 成功获得高质量的截短ALT1无标签蛋白及其特异的多克隆抗体,为ALT1的免疫学检测试剂的研发提供了依据。     

椰子花粉过敏原的分离、鉴定与纯化

目的 对椰子花粉的变应原组分进行初步的分离、鉴定及纯化.方法 提取椰子花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDS-PAGE)分离椰子花粉的蛋白质组分并测定其相对分子质量,采用免疫印迹法鉴定其变应原成分,并通过离子交换层析对椰子花粉变应原进行初步分离纯化,免疫印迹进行检测.结果 SDS-PAGE显示椰子花粉粗提液有10条蛋白带,其中相对分子质量(肘,)为60 000、50 000、35 000、28 000、19 000、16 000和14 000的蛋白可与椰子花粉过敏性病人血清IgE结合,且M,50 000、16 000和14 000为主要变应原;离子交换层析结果显示主要过敏原成分主要分布在V峰中.结论 对椰子花粉变应原进行了初步的分离、鉴定和纯化,为临床椰子花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础.     

斑节对虾过敏原的分离、鉴定与纯化

目的 对斑节对虾的主要过敏原进行分析、鉴定与纯化.方法 通过SDS-PAGE电泳分离斑节对虾的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对斑节对虾主要过敏原进行初步纯化.结果 斑节对虾粗提液SDS-PAGE显示其主要蛋白条带主要有7条,Western-blotting显示对斑节对虾过敏患者的阳性混合血清能与7个蛋白条带起反应,相对分子质量分别为71 000、43 000、34 000、23 000、21 000、20 000和19 000,离子交换层析可初步纯化出相对分子质量为34000和21 000的过敏原蛋白.结论本实验对斑节对虾过敏原进行了分离和鉴定,并初步纯化出斑节对虾的主要过敏原.     

花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

乙型肝炎病毒PreS1基因的原核表达及免疫学性质鉴定

目的 构建含乙型肝炎病毒(HBV)PreS1基因的原核表达载体,获得高纯度、有生物活性的PreS1重组蛋白.方法 采用PCR法扩增PreS1及其N末端和C末端部分基因序列,克隆入原核表达载体pGST-MOLUC.重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测.用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶亲和层析纯化的重组融合蛋白免疫新西兰家兔,制备GST-PreS1融合蛋白的抗血清.进一步用ELISA分析融合蛋白特异抑制HBV病毒与抗体结合的能力.结果 重组质粒转化宿主菌后成功诱导出Mr39 000、31 000和32 000的GST-PreS1、GST-PreS1N及GST-PreS1C融合蛋白,均与预期相对分子质量相符.Western blot检测获得特异的杂交条带.采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶纯化的融合蛋白纯度约为90%左右.融合蛋白免疫家兔后抗体滴度达到10-7.病毒捕获ELISA实验表明,融合蛋白能特异抑制病毒与家兔免疫血清结合.结论 GST-PreS1融合蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,其纯化产物是研究PreS1基因在HBV感染过程中作用的有用工具.