pEGFP/A_2M(FP_6)转染神经干细胞海马移植治疗APP/PS1双转基因AD小鼠的实验观察

目的:携带pEGFP/A2M(FP6)的神经干细胞(NSCs)定向移植到APP/PS1双转基因AD小鼠海马内,观察移植细胞的分化、迁移,脑内Aβ沉积的变化,以及对AD小鼠学习记忆功能的影响。方法:APP/PS1转基因AD小鼠分为假手术(SO)组、人工脑脊液(ACSF)组、转染pEGFP的NSCs(pEGFP-NSCs)组及转染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs(pEGFP/A2M(FP6)-NSCs)组,移植物小鼠海马CA1区定位注射,水迷宫实验检测小鼠认知功能,免疫组化观察小鼠脑内移植细胞的分化、迁移及Aβ病理变化。结果:pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组和pEGFP-NSCs组转基因小鼠逃避潜伏期较SO组及ACSF组显著缩短(P<0.05);pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组转基因小鼠逃避潜伏期较pEGFP-NSCs组缩短(P<0.05)。pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组和pEGFP-NSCs组转基因小鼠海马及皮质内,部分Aβ染色阳性斑块周围可见表达EGFP的移植细胞。pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组转基因小鼠额叶、海马区域,Aβ染色阳性斑块数量和平均面积均较其他3组显著减少(P<0.05)。移植的NSCs,部分细胞Nestin染色呈阳性,部分细胞GFAP染色呈阳性,少数细胞MAP-2染色呈阳性。结论:移植pEGFP/A2M(FP6)NSCs到APP/PS1双转基因AD小鼠海马,可减少AD小鼠脑内Aβ斑块沉积,部分移植的NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,小鼠的学习记忆功能显著改善。     

超声微泡介导pGPU6/Neo质粒转染神经干细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡介导pGPU6/Neo 质粒转染神经干细胞(NSCs)的效率及可行性.方法 以一定能量的超声介导质粒转染大鼠NSCs,分为:空白组、质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组、质粒+微泡+超声组,并按不同转染条件分为亚组.转染48 h后荧光显微镜观察转染效率,台盼蓝染色法检测细胞活性.结果 最优参数为声强1....     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescen ceprotein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—HPV16 E6。方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP—HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位，用Western blot方法验证其蛋白的表达。结果 表明在空载体pEGFP—C2转染组中，Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP—HPV16 E6转染组中，绿色荧光集中在细胞核中。Western blot的结果确证了pEGFP—HPV16 E6融合蛋白的表达。结论 提示pEGFP—HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及业细胞定位，为HPV16 E6的功能研究提供了线索。     

大鼠SLPI基因真核表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的 克隆大鼠白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)基因,构建其真核表达载体,并转染大鼠真皮多能干细胞,以探讨SLPI在创伤及炎症性疾病中的意义.方法 PCR扩增大鼠皮肤SLPI基因 cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N2重组,将SLPI基因 cDNA片段连接到pEGFP-N2载体的多克隆位点,形成重组载体pEGFP/SLPI,转化大肠杆菌DH5α菌株,构建成SLPI基因真核表达载体质粒.扩增DH5α后抽提质粒DNA,Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切,电泳,DNA测序鉴定.鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染大鼠真皮多能干细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR方法 来检测基因转染及表达.结果从大鼠皮肤cDNA扩增出392 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N2载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为SLPI基因,插入方向正确.重组质粒经脂质体转染真皮多能干细胞,24 h后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的 基因SLPI表达.结论 大鼠SLPI基因的克隆和真核表达载体构建获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础.     

重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞条件的优化

背景:血管内皮生长因子能够提高骨细胞的增殖能力,促进骨折局部血管发生,在骨缺损修复过程中发挥着至关重要的作用.目的:优化重组真核质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞的条件,为构建新型组织工程骨种子细胞提供实验基础.方法:体外分离、培养并鉴定兔成骨细胞.分别应用0.8,1.0,1.2 μg的质粒和1.5,2.0,2.5,3.0 μL脂质体两两组合,通过脂质体法将重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染入兔成骨细胞,转染48 h后倒置荧光显微镜下观察并测定转染率.结果与结论:随着脂质体剂量的增加,成骨细胞死亡增多.转染48 h后,倒置荧光显微镜下可见细胞质内发绿色荧光的小颗粒成弥散分布,或在核周浓集成块状.其中,脂质体2.5 μL和质粒1.2 μg条件下的转染率最高,可达56%.说明质粒与脂质体之间的交互作用能够显著影响转染率,脂质体2.5 μL和质粒1.2 μg是转染兔成骨细胞的最佳条件.     

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16.1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达.方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4 DNA Ligase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP.重组质粒经酶切及测序鉴定.将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果.结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达.结论:成功构建真核表达质粒DENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制.     

凝血因子ⅩⅢA基因Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变致凝血因子ⅩⅢ缺陷的分子机制

本研究以凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)基因突变为研究的切入点,从分子水平研究这些突变致病的机制.构建野生型FⅩⅢA重组表达质粒,用定点突变方法获得含有2种突变(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重组表达质粒.分别将上述重组质粒通过脂质体介导的基因转移方法转染到COS-7细胞表达;用发色底物法检测转染细胞中FⅩⅢ活性,荧光定量RT-PCR、Western blot及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测转染细胞中人FⅩⅢA的RNA表达水平和蛋白表达量.结果表明:含有2种突变( Arg77Cys及Arg174 stop)的FⅩⅢA重组质粒转染组FⅩⅢA mRNA 相对表达丰度分别为0.82 +0.21和0.76±0.17,与野生型FⅩⅢA重组质粒转染组(1.06±0.51)比较没有显著性差异(p＞0.05).野生型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物中FⅩⅢ活性为(61.6±30.4)％,浓缩的细胞培养上清液中FⅩⅢ活性为(24.0±2.9)％,而2种突变型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物及培养上清液FⅩⅢ活性明显减低.转染细胞裂解物的Westem blot分析显示,含Arg77Cys错义突变的FⅩⅢA重组蛋白在培养细胞内含量明显减低,仅见1条微弱的条带.ELISA证实,野生型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物中FⅩⅢA:Ag量为(32.8±14.5)％,浓缩的细胞培养上清液中FⅩⅢ:Ag量为(13.2±2.3)％.而2种突变型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物及培养上清液中FⅩⅢA:Ag水平极度减低,低于ELISA检测低限.结论:FⅩⅢA Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变未导致FⅩⅢA mRNA水平的显著减低,但都可以导致FⅩⅢA蛋白水平的表达异常.在本研究先天性FⅩⅢ缺陷症患者中FⅩⅢA重度缺乏可能是FⅩⅢA Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变的共同作用所致.     

骨髓间充质干细胞表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白的提纯及功能鉴定

目的:用hVEGF_(121)/EGFP真核质粒转染骨髓间充质干细胞,提纯其表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白,并体外检测其功能.方法:用课题组前期工作构建的pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒提取质粒DNA.通过阳离子脂质体介导pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒DNA转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达.用Amicon超滤离心管纯化融合蛋白.结果:荧光显微镜下观察到转染pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒的骨髓间充质干细胞,Westen blot证实转染骨髓间充质干细胞的培养液中存在hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达.MTT试验证实人脐静脉内皮细胞数量在hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白组明显多于对照组(P<0.05).Miles实验证实hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白增加血管壁的通透性.结论:①携带hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,在骨髓间充质干细胞中获得表达.②骨髓间充质干细胞表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白在体外具有野生型血管内皮细胞生长因子的功能.     

人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒体外转染人黑色素瘤细胞B16的抗肿瘤效应

目的:将人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒于人黑色素细胞B16转染,检测其对抗肿瘤效应的影响.方法:选用人黑色素瘤细胞株B16,设4个组:A组,转染P1/Fas-Mip3β-pIRES组;B组,转染P1/Fas-pIRES组;C组,转染Mip3β-pIRES组;D组,转染pIRES组.转染方法采用Invitrogen(美国)公司的LipofectamineTM2000脂质体转染的方法(6孔板,8×105孔,2mL体系).分别流式细胞仪检测细胞凋亡率,进行体外补体介导的细胞杀伤(CDC)实验和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验,获得细胞活力并进行统计学分析.结果:重组质粒成功转染人黑色素瘤细胞株B16:(1)流式细胞仪检测双表达组组细胞凋亡率87.6%,明显较其他组别高.(2)CDC试验发现最小均值的组合为20g/L组B肽-MIP-pIRES.(3)ADCC试验发现最小均值的组合为40∶1组B肽-MIP-pIRES.结论:人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒能在人黑色素细胞B16转染,诱导肿瘤细胞凋亡,并通过CDC及ADCC效应增强免疫反应.     

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells．NSCs）的体外培养，探讨NSCs作为基因靶细胞．以及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标记NSCs的可行性。方法：胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞，无血清细胞培养，免疫细胞荧光染色技术鉴定。NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs，用G418筛选，在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆．并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定。结果：从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力。表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达，且不影响其增殖、分化能力。结论：小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养；神经干细胞可直接作为基因靶细胞；转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠神经干细胞移植于损伤脊髓后的迁移和存活

目的观察神经干细胞在体内的迁移和存活。方法体外培养胎鼠脊髓神经干细胞,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体进行转染,以乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)为支架移植入大鼠T9半横断脊髓损伤处。移植后1个月在荧光显微镜下观察神经干细胞在脊髓内的迁移,并计算其存活率。结果神经干细胞表达强烈的绿色荧光。细胞移植后1个月,在损伤脊髓的头端和尾端都可见GFP阳性细胞,计算出的存活率为(1.4911±0.0313)%。结论GFP标记的神经干细胞移植入大鼠损伤脊髓后向脊髓组织内迁移并有少数存活。     

FGF-2,NT-3对海马表皮生长因子反应性神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:比较碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)和神经营养素3(NT-3)对海马表皮生长因子(EGF)反应性神经干细胞(NSC)分化为神经元的诱导作用。方法:在含EGF的培养体系中分离培养NSC,免疫荧光染色检测NSC特征性标志nestin的表达,Brdu掺入实验检测细胞增殖状态。将NSCs接种在6孔培养板中,分成4组:FGF-2组、NT-3组、FGF-2+NT-3组和对照组。培养10d时,用免疫细胞化学染色和荧光标记技术检测其神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率。结果:FGF-2和NT-3均可诱导EGF反应性NSC分化为神经元,FGF-2优于NT-3。对照组神经元细胞分化率低,仅为3.70%。联合应用FGF-2和NT-3,可使神经元分化率增加约10倍。结论:FGF-2与NT-3联合作用能更好地促进海马EGF反应性NSC分化为神经元细胞。     

大鼠神经干细胞与"癫痫样细胞"体外共培养后的分化发育料

背景:在癫痫微环境神经干细胞能否被诱导分化为异常放电的"癫痫神经元"?癫痫微环境包括两种情况:一是"无镁"细胞外液,二是与癫痫细胞共培养.其中前者比后者的致癫痫作用强.目的:模型模拟体内癫痫微环境,将大鼠海马神经干细胞和正常海马神经元以及"癫痫神经元"体外共培养,观察干细胞的分化发育情况.设计:重复测量观察.单位:哈尔滨医科大学附属第一医院.材料:实验于2005-08/2007-04在哈尔滨医科大学病原学教研室及药理学教研室完成,选用150只新生Wistar大鼠,雌雄不拘,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.兔抗鼠突触素抗体购自美国LabVision公司.携带增强型绿色荧光蛋白标记基因的血清型2型腺相关病毒购自北京本元正阳公司.Axopatch 200B放大器为美国Axon公司产品.5111A示波器为美国Tektronix公司产品.方法:①分离大鼠海马神经元,采用"无镁"外液处理神经元建立"癫痫神经元"模型.常规方法培养大鼠海马神经干细胞,将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞分别与正常海马神经元、"癫痫神经元"共培养14 d.②应用膜片钳记录与两种神经元共培养后细胞突触后电位:利用免疫荧光检测神经干细胞突触素抗体染色情况:将神经干细胞分化的神经元放入"无镁"外液,应用膜片钳记录其突触后电位.主要观察指标:①海马神经干细胞与两种神经元共培养14 d后突触后电位、突触素抗体染色结果.②分化后神经元在.无镁"外液中突触后电位及"癫痫样放电"情况.结果:①神经干细胞与正常海马神经元共培养后,膜片钳记录到60%(6/10)神经干细胞14次/5min兴奋性突触后电位;与"瘴痫神经元"共培养后记录到12次/5 min兴奋性突触后电位.②神经干细胞分别与正常海马神经元及"癫痫神经元"共培养后,免疫荧光检测均显示80%(12/15)表达绿色荧光蛋白的干细胞突触索抗体染色阳性.③60%(9/15)干细胞分化的神经元在"无镁"外液中出现14次/5 min时程约10 s的兴奋性突触后电位,未记录到"癫痫样放电".结论:大鼠海马神经干细胞与"癫痫神经元"体外共培养后可形成功能性突触,未转变成"癫痫神经元".     

远志总皂苷对神经干细胞向神经元分化的影响

目的:观察远志总皂苷对神经干细胞(NSCs)向神经元分化的影响.方法:分离、培养并鉴定新生大鼠海马区NSCs,分别添加终浓度5 μg/mL、20 μg/mL及100 μg/mL的远志总皂苷进行诱导1 d或3 d.免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.结果:原代与传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成悬浮...     

离体实验条件下胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的观察

背景有关神经干细胞(neural stem cells,NSCs)治疗研究有明显增多趋势,已有许多研究认为NSCs能够增殖分化并在中枢神经系统内发生神经整合,NSCs在中枢神经系统中迁移的特性已成为近年来干细胞治疗神经系统疾病研究的热点.目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达.设计重复测量设计.单位解放军第三军医大学新桥医院神经外科、中南大学湘雅医院神经外科、Department of Urology,National Defense Medical College.材料新生第1天Wistar大鼠,由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法通过构建真核表达质粒pCMVCD,限制性内切酶消化鉴定后,采用Lipofectamine2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区NSCs,G418筛选阳性克隆,加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),MTT比色法测定NSCs的生存率.主要观察指标MTT比色法测定NSCs的生存率.结果本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞,并将CD基因成功地转染了神经干细胞.基因转染使G418抗性细胞(NSCs/CD细胞)对5-FC高度敏感.未转染的NSCs对5-FC不敏感,IC50约为5 000 μmol/L,而转染基因后ICs0小于10 μmol/L.G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感.结论CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗神经系统退行性病变及多种疾病研究提供依据.     

Ezrin影响胶质瘤在裸鼠脑内的浸润性生长

目的应用RNAi沉默Ezrin基因或表达载体使其过表达以探讨Ezrin基因对脑胶质瘤生长的影响。方法根据GenBank中Ezrin的基因序列,应用Designer3.0（Genepharma）软件设计以Ezrin基因4个位点为靶的shRNADNA oligo,合成并克隆至shRNA载体pGPU6/GFP/Neo;构建其shRNA载体。经BamHⅠ、PstⅠ酶切鉴定和测序分析,再以脂质体LipofectimineTM2000介导转染U87细胞,48h后用RT-PCR和Western blot检测Ezrin mRNA和蛋白的表达,以筛选有效shRNA载体。将转染Ezrin基因有效shRNA载体和表达载体的U87细胞接种裸鼠脑,制备脑瘤动物模型,激光共聚焦显微镜下观察U87细胞在裸鼠脑内的迁移情况。结果经限制性内切酶切和测序鉴定分析所构建的shRNA-Ezrin正确;RT-PCR和Western blot检测结果表明,shRNA-Ezrin-2可沉默Ezrin表达,使其mRNA和蛋白表达量降低,确定为有效shRNA载体。激光共聚焦显微镜下可见shRNA-Ezrin-2转染的U87细胞在裸鼠脑内迁移数少于对照组,pEGFP-C1/Ezrin转染的U87细胞的迁移数相对较多。结论成功构建Ezrin基因的shRNA载体并筛选出有效shRNA载体。Ezrin基因参与U87细胞在裸鼠脑内的浸润性生长。