大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源肺腺癌单链抗体基因文库的构建

目的:制备人源抗肺腺癌单链抗体(Single-chain variable fragment,scFv)基因文库.方法:利用肺腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,通过RT-PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过"剪切重叠延伸PCR"(Splicingover-lapping extend PCR,SOE-PCR)而形成scFv基因片断.将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转入Ecoli TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物.结果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源抗肺腺癌scFv基因片断,为进一步筛选人源抗肺腺癌scFv库提供了试验基础. 入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转AEcoh TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物. 果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因

目的:利用噬菌体表面展示技术制备抗人DR5单链抗体.方法:从抗DR5杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv基因.将scFv与PAK100载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌XL1-Blue,经VSCM13辅助噬菌体拯救,构建成鼠抗人DR5单链抗体库...     

人源甲状腺髓样癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的：应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）噬菌体单链抗体库。方法：提取ＭＴＣ病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因VH和VL基因片断,以它们为模板分别扩增VH-Linker和VL-Linker,再用剪切重叠延伸ＰＣＲ技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段（single chain fragment variable,scFv）后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果：MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5％（21/24）。结论：成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。     

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。 方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定。 结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性。 结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达

目的　构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法　用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果　获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论　我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的 构建抗CD44抗体的单链抗体（anti-CD44-ScFv），为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法 从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA，经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区（VL、VH）基因，用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因，并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PEV22b（＋）中进行表达。结果 经测序表明，VH、VL及Linker的序列正确。ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16％。能够特异性与CD44抗原结合。结论 成功构建抗CD44抗体单链抗体，为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的：构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体，降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法：采用RT－PCR技术，从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI315B分离克隆抗体轻重链可变区基因，对其进行序列分析，将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链，然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体pcDNA3。结果：构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论：人鼠嵌合抗体的构建为它的表达和临床应用打下基础。     

Tumor cell- specific gene transfer with retroviral vectors displaying single- chain antibody

Objective To specifically deliver the therapeutic gene to cancer cells and construct target retroviral vectors by inserting the single- chain variable antibody fragment into the retroviral envelope. Methods Single- chain antibody expression vector pET - 20bScfv was constructed. Binding activity of the genetically engineered single- chain variable antibody fragment was verified by enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot. At the same time, by means of polymerase chain reaction (PCR)- directed mutagenesis, the appropriate cloning site EcoT22 Ⅰ/Sal Ⅰ was generated at the N- terminus of receptor- binding SU domain in the MoMLV env polypetide. Then the single- chain antibody gene, encoding a functional antibody, was inserted into the cloning site. The Scfv- env fusion gene fragment was subcloned into CMV expression vector. The Lac- Z retrovirus that co- displayed the Scfv- env chimeric protein and wild- type env protein was produced by transfection of] Ψ2 cells with retroviral plasmid and the fusion gene expressing plasmid. To confirm the specificity of the recombinant retrovirus, infection assays and competitive inhibition assays were performed. Results The results of ELISA and Western blot showed that the genetically engineered single- chain variable antibody fragment could bind to the SHG44 cells surface membrane antigen. Virus- binding assay, viral infection and competitive inhibition assays confirmed that the harvested virus efficiently bound to and infected SHG44 cancer cells expressing the relative membrane antigen specially via the recognition of the target antigen. Conclusion These results imply that insertion of Scfv into the retroviral envelope can specifically deliver the interested gene into specific antigen- producing cancer cells.     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

目的 构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法 应用重组ＤＮＡ技 术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保 证在同一阅读框架,然后分别插科到pcＤＮＡ３和ＰＭＪＫ３两种真核表达载体中。结果构建成可以在真核细胞中分泌表 达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcＤＮＡ３－Ｄ１和ｐＭＪＫ３－Ｄ１。结论为建 立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。     

抗血小板膜糖蛋白Ⅰba／Ⅲa双特异单链抗体的构建及其功能研究

目的：构建、表达抗血小板膜糖蛋白（GP）Ibα/GPⅢa双特异单链抗体,为其进一步研究、应用奠定基础。方法：应用PCR技术,扩增出接头片段和SZ-21单链抗体基因,克隆入pUm-T载体,测序分析。应用基因重组技术将接头片段、SZ-21单链抗体基因和SZ-2单链抗体基因重组拼接,构建SZ-2/SZ-21双特异单链抗体表达载体pET22-21-L-2scFv,并测序验证。导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys,诱导表达。流式细胞术、ELISA、Western印迹检测SZ-2/SZ-21双特异单链抗体与血小板结合能力,瑞斯托霉素、凝血酶和ASP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究。结果：表达载体pET22-21-L-2scFv构建拼接正确;表达产物以包涵体形式为主,表达量占菌体总蛋白的14％;表达产物具有与血小板以及血小板GP Ibα和Ⅲa结合的活性,可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集,此作用呈剂量依赖性。结论：成功表达了SZ-2/SZ-21双特异单链抗体,该抗体具有与相应2相靶抗原结合的活性,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集。     

抗人宫颈癌单链抗体的表达、结构预测和功能分析

目的扩增、表达抗人宫颈癌单链抗体（ScFv）基因;对ScFv蛋白进行活性鉴定、二级结构、三维结构预测和理化性质分析。方法采用基因重组技术构建抗人宫颈癌ScFv基因,进行TG1和HB2151两个原核体系的表达;SDS-PAGE、Western blotting、竞争抑制实验、免疫组化反应检测ScFv;用Antheprot 4．3软件、Swiss-model、3dpssm进行蛋白理化性质分析和立体结构模拟。结果抗人宫颈癌可溶性ScFv大小为32000左右,与预计蛋白相对分子质量相符;可溶性和展示性ScFv均可与人宫颈癌细胞株细胞膜表面抗原结合。免疫组化显示能与宫颈癌组织特异性结合而不与正常宫颈组织和其他肿瘤组织结合。ScFv蛋白等电点预测值为7．215,属于α＋β蛋白;VH和VL区均有多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点。三维结构预测显示linker贴近。使VL和VH形成一个疏水的“口袋”。这一结构有利于抗原的结合。结论经基因工程方法制备的抗人宫颈癌ScFv具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性和特异性。抗人宫颈癌ScFv构建为进一步构建双特异性ScFv和双功能ScFc基因创造了条件;其成功的表达为人宫颈癌的早期诊断和特异性治疗打下了基础。计算机对ScFv蛋白的空间结构的模拟和理化性质的分析为ScFv的进一步政建和抗原、抗体反应的研究提供了宝贵的资料。     

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的：构建含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法：利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3／MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3／MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果：构建了含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论：重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。     

曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡反义cDNA文库的构建和效应基因的初步筛选

目的 构建曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞凋亡反义cDNA文库,以筛选曲古霉素A抗肿瘤的效应基因.方法 收集经曲古霉素A处理不同时间点的人乳腺癌细胞MCF-7,提取poly(A)+RNA,将逆转录合成的cDNA反向插入载体PCEP 4中以构建反义cDNA文库.文库DNA随机转入人宫颈癌细胞HeLa中,以转染PCEP 4卒载体细胞为对照组,用200 nmol/L曲古霉素A和200μg/ml潮霉素同时筛选,至对照组细胞全部死亡,文库组仍有存活细胞时停止曲古霉素A筛选.存活克隆扩增后提取Hirt DNA并转化感受态细胞,获得的转化克降扩增后进行酶切鉴定并测序,得到多个EST片段,经生物信息学分析后选择感兴趣的EST片段进行初步功能验证.结果 构建的反义cDNA文库含有2 × 106重组子,重组效率>90%;经DNA测序和生物信息学分析提示第27号存活克隆是锌转运蛋白LIV1,该克隆在功能验证时表现出对曲古霉素A非常显著的抵抗效应.结论构建的反cDNA文库容量较大,质量较高;基因LIV1可能是曲古霉素A抗肿瘤的效应基因之一.     

抗乳腺癌人单抗CM—1重链可变区基因的序列测定与分析

为存留抗乳腺癌人单抗CM－1的可变区编码基因，从CM-1杂交瘤细胞中提出总RNA，经逆转录生成cDNA，PCR后得到一400hP左右的基因扩增片段。用一条内引物直接对PCR产物进行基因序列测定，测得344个碱基序列，与已知人抗体重链可变区的读码框架相符，其对应的氨基酸序列属人抗体可变区“典范结构”的1～3类，从而进一步验证了CM-1单抗的人源性，并为人抗体编码基因的研究提供了新资料，也为制备CM－1小分子抗体作了准备。