复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的作用研究

目的观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用,及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用,并对其机制进行探讨。方法利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞）中。结果①携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达;②将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达;③将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠,其体内致瘤性明显降低,且对野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用;④瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。该结果提示,利用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

腺病毒载体介导的bFGF基因体外转染大鼠平滑肌细胞的实验研究

目的观察携带bFGF基因的重组腺病毒体外转染平滑肌细胞的效率及转染后目的基因的表达。方法应用磷酸钙共沉淀法分别构建携带bFGF基因和大肠杆菌LacZ报道基因的重组腺病毒载体Ad．bFGF和Ad．LacZ,并以Ad．bFGF（组Ⅰ）、Ad．LacZ（组Ⅱ）、PBS（组Ⅲ,对照组）转染体外培养的大鼠平滑肌细胞（SMCs）。X—gal染色检测腺病毒载体的转染效率,噻唑蓝（MTT）检测各组SMCs的增殖情况,酶联免疫吸附（ELISA）检测各组培养液中bFGF蛋白的浓度。结果当MOI值为100时,X-gal核蓝染细胞比率达95％以上;组ⅠSMCs的增殖水平显著高于组Ⅱ和组Ⅲ（P〈0．01）;ELISA方法检测,在转染后第1天组Ⅰ培养波中即有bFGF蛋白的分泌表达,第3天达峰值后分泌量逐渐下降,第8天仍能检测到少量分泌,而组Ⅱ和组Ⅲ培养液中均未检测到bFGF蛋白。结论成功地将所构建的Ad. bFGF转染体外培养的SMCs,并在培养液中检测到目的基因的蛋白表达。     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

[目的]构建神经营养素 3(NT 3)基因转染的施万细胞.[方法] NT 3基因重组腺病毒(AdvNT 3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(SCs).用免疫细胞化学和 ELISA方法分别检测 NT 3基因转染 SCs的 NT 3表达及培养液中 NT 3的含量. [结果]实验中获得的 AdvNT 3中外源基因序列与大鼠 NT 3的 DNA序列完全一致,与未基因转染 SCs相比,NT 3基因转染 SCs的 NT 3阳性增强,培养液中 NT 3含量增高.[结论]通过腺病毒介导可以获得 NT 3过量表达的基因转染 SCs.     

腺病毒介导的小鼠γ-干扰素在小鼠肺上皮细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的小鼠γ干扰素（ｍＩＦＮγ）在小鼠肺上皮细胞内的转基因表达。方法：腺病毒介导的ｍＩＦＮγ在小鼠肺上皮细胞内的转基因，其表达的ｍＩＦＮγｍＲＮＡ、蛋白质及生物活性分别经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、ＥＬＩＳＡ和抑制鼠弓形体在小鼠巨噬细胞内生长等检测技术确定。结果：病毒的细胞感染增殖率（ＭＯＩ）５０为腺病毒介导的ｍＩＦＮγ在小鼠肺上皮细胞内表达的最适浓度：在感染６ｈ后经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交发现ｍＩＦＮγｍＲＮＡ转录信号，２４ｈ达高峰；在感染１２ｈ后经ＥＬＩＳＡ检测ｍＩＦＮγ蛋白的表达阳性，４８ｈ后达峰值。经重组腺病毒感染的小鼠肺上皮细胞培养上清液中的ｍＩＦＮγ可明显抑制鼠弓形体在经大肠杆菌脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞内的生长。结论：小鼠的ＩＦＮγ可经腺病毒介导向小鼠肺上皮细胞的转移，并可实现早期、高效且相对持久的表达，为细胞因子的体内转基因免疫治疗机制研究奠定了基础。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

【目的】构建神经营养素-3(NT-3)基因转染的施万细胞。【方法】NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)扩增、纯化和测定后，转染体外培养的施万细胞(SCs)。用免疫细胞化学和ELISA方法分别检测NT-3基因转染SCs的NT-3表达及培养液中NT-3的含量。【结果】实验中获得的AdvNT-3中外源基因序列与大鼠NT-3的DNA序列完全一致，与未基因转染SCs相比，NT-3基因转染SCs的NT-3阳性增强，培养液中NT-3含量增高。【结论】通过腺病毒介导可以获得NT-3过量表达的基因转染SCs。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。     

腺病毒介导的干扰素-β基因对SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的:观察腺病毒介导的干扰素-β(IFN-β)基因能否诱导人肝癌SMMC-7721细胞体外凋亡.方法:用HEK293A细胞扩增重组腺病毒介导的人干扰素-β(AdhlFN-β)基因,经纯化后用空斑形成实验法测定病毒滴度;分别用AdhIFN-β基因和重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白(AdGFP)基因转染人肝癌SMMC-7721细胞.并设空白对照组.应用免疫细胞化学方法检测hIFN-β基因的表达,应用Hochest 33342荧光染色法和流式细胞术检测转染重组AdhIFN-β基因组、空载体组和对照组细胞的凋亡情况.结果:重组腺病毒经HEK293A细胞扩增、纯化后滴度可达2×1011 pfu/mL,且40 MOI的腺病毒即可获得95%以上的转染效率;免疫细胞化学法检测到外源性hIFN-β基因在SMMC-7721细胞中的蛋白表达产物;荧光染色法检测到重组AdhIFN-β基因组细胞明显发生了凋亡,而重组AdGFP组和空白对照组细胞凋亡不明显;流式细胞术检测到转染重组AdhIFN-β基因组细胞凋亡率[(28.27±4.21)%]高于转染空载体组[(2.08±0.89)%]和对照组[(1.53 4±0.70)%](F=377.625,P<0.001),后2组细胞凋亡率比较差异无统计学意义.结论:腺病毒介导的hIFN-β基因能诱导体外肝癌细胞发生凋亡.     

腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究

目的 :了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况 .方法 :将含有 β 半乳糖苷酶 (beta galactosidase,β gal)报告基因的腺病毒 ,在 1× 10 9～ 1× 10 11nfu·L-1的滴度下 ,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内 ,3d ,1,2 ,3和 4wk后用 β gal染色法观察 β gal基因在眼组织内的分布情况 .结果 :各病毒滴度组均可有效地转染外源基因 ,且未观察到细胞病理改变 .玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β gal基因表达 ,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达 ,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达 ,球旁注射组眼外肌有表达 .注射 3d后开始出现 β gal基因阳性表达 ,持续达 4wk以上 .结论 :腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、视网膜     

腺病毒介导CTLA4Ig基因在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA4Ig在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。方法 以肾小管上皮细胞（PK－15），血管内皮细胞（ECV－304）为靶细胞，观察感染强度为100，200，400时CTLA4Ig重组腺病毒转梁靶细胞后不同时相细胞存活百分率；以免疫组化以及Westerb blot分别检测CTLA4Ig在细胞以及上清中的表达。结果 转染后2d,4d，转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异；转染后24h,CTLA4Ig在PK－15和ECV－304中的阳性率表达率分别为93．7％和90．2％；Westerb blot检测到两种细胞上清中均有CTLA4Ig表达。结论 重组腺病毒对非包装靶细胞毒性很小，能够介导CTLA4Ig基因对靶细胞的高效转染，并使其表达分泌型CTLA4Ig，具备了以基因治疗诱导免疫耐受的潜能，为介导CTLA4Ig基因转染移植物和抗原提呈细胞提供了一种安全有效的载体。     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16 h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubu lin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P〉0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞,测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况,进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase,pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低,通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接,腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的:构建以鼠心肌轻链蛋白基因(mlc-2v)为启动子、携带人血管内皮生长因子hVEGF165基因的重组腺病毒载体,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性.方法:酶切腺病毒载体PDC315自身启动子CMV,构建腺病毒载体PDC317,分别接入hVEGF165、mlc-2v基因,构建腺病毒载体PDC-mlc-hVEGF165.鉴定正确后,将PDC-mlc-hVEGF165与Lipofectamine共转染至293细胞,经同源重组获得以mlc-2v为启动子、携带hVEGF165基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165,同步构建无靶向性的重组腺病毒Ad-hVEGF165.扩增并测定滴度后,Ad-hVEGF165、Ad-mlc-hVEGF165分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测Ad-mlc-hVEGF165转染心肌细胞的靶向性.结果:构建的病毒正确,病毒滴度为2.8×109 pfu/ml.转染3 d后,Ad-hVEGF165组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到VEGF的表达,而Ad-mlc-hVEGF165组仅在心肌细胞中有VEGF的表达,且Ad-mlc-hVEGF165组心肌细胞分泌的VEGF要少于Ad-hVEGF165组.结论:成功构建了以mlc-2v为启动子、携带人VEGF基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165;该重组载体能体外靶向性转染心肌细胞并使之表达VEGF.     

基因表达谱芯片技术筛选β干扰素基因转染细胞的反式调节基因

目的:筛选能被β干扰素反式调节的靶基因,研究β干扰素的生物学功能及其机制。方法:设计并合成β干扰素(IFNβ)特异性引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的IFNβ编码基因片段克隆到TA载体中,进行测序鉴定后构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-IFN-β。以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,转染HepG2细胞,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果:HepG2细胞经转染IFN-β之后,有70条差异基因表达,其中40条基因表达增强,30条基因表达降低。这些差异表达基因与细胞的增生、分化和细胞的信号转导密切相关。结论:应用基因表达谱芯片技术筛选到IFN-β的反式调节基因,为进一步探索IFN-β可能的调节机制及其生物学功能提供了新的依据。     

腺病毒介导的AT2R基因转染对培养大鼠颈动脉内膜增生的影响

目的构建AT2R重组腺病毒载体并研究AT2R对动脉损伤后新生内膜增生的影响.方法将AT2R基因克隆至腺病毒载体,构建AT2R重组腺病毒;球囊损伤大鼠颈动脉后立即取下颈动脉,用重组腺病毒转染,在体外培养2周后,观察AT2R基因转染对损伤动脉新生内膜形成的影响.结果构建的AT2R重组腺病毒经鉴定正确,其滴度为1×109pfu/ml;AT2R重组腺病毒转染可明显抑制培养大鼠颈动脉新生内膜增生.结论成功构建了AT2R重组腺病毒载体;AT2R可明显抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的新生内膜增生.     

人IFN-β基因脂质体转染胶质瘤细胞对凋亡的诱导作用

目的:观察β-干扰素(IFN-β)基因脂质体pSV2IFN-β转染人胶质瘤细胞系SHG44及其转染后对SHG44细胞的凋亡诱导作用. 方法:应用MTT比色法检测脂质体pSV2IFN-β转染后转染组与对照组SHG44细胞增殖的差异;细胞免疫荧光染色检测脂质体pSV2IFN-β转染后,SHG44细胞IFN-β的表达情况. 应用流式细胞仪Annexin法检测脂质体pSV2IFN-β转染后SHG44细胞的凋亡情况,采用透射电镜观察肿瘤细胞凋亡的形态学改变. 结果:IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β转染SHG44胶质瘤细胞系后4 d和6 d时,对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,抑制率分别为16.7%和32.7%. 细胞免疫荧光法检测表明转染后胶质瘤细胞具有显著的IFN-β表达,流式细胞仪Annexin法检测表明转染组与对照组的凋亡率分别为66.8%与19.8%,两组相比具有显著差异(P＜0.01);透射电镜观察,发现有凋亡细胞存在,表现为细胞皱缩,染色质边集. 结论:IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β可转染SHG44胶质瘤细胞系,并对胶质瘤细胞的凋亡具有明显的诱导作用.     

阳离子脂质体介导β干扰素基因转染对人胶质瘤细胞的抑制作用

目的:建立阳离子脂质体载体,介导β干扰素(IFN-β)基因转染人胶质瘤细胞系,观察其生长抑制作用.方法:以反相蒸发法制备含IFN-β的阳离子脂质体载体,转染SK-MG-1胶质瘤细胞系.MTT法观察其生长抑制情况,流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡.结果:阳离子脂质体介导IFN-β基因转染可抑制SK-MG-1细胞的生长,抑制作用强于IFN-β蛋白.IFN-β蛋白和基因转染可以诱发SK-MG-1细胞的凋亡.结论:阳离子脂质体可作为一种有效的载体应用于胶质瘤的基因治疗中.IFN-β可抑制胶质瘤细胞系SK-MG-1的生长,诱发凋亡.