成年恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养

目的温对猴骨髓基质干细胞(BMSCs)进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。方法 抽取4只成年猴髂骨骨髓，用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs，胰酶消化传代，用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况，对传代细胞进行HE染色及碱性磷酸酶(ALP)染色。结果 成年雄性恒河猴BMSCs体外培养生长良好，原代细胞10-13d汇成单层，传代后4～7d长满瓶底。HE染色光镜下观察见BMSCs为单核细胞，细胞呈梭形、多角形，传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论 猴BMSc的体外培养增殖能力强，可诱导为成骨细胞，可作为灵长类动物骨组织工程的种子细胞。     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

富血小板血浆与地塞米松对人骨髓基质干细胞成骨分化作用的对比研究

目的 通过系统评价富血小板血浆(PRP)与地塞米松(DEX)对人骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,为PRP临床骨组织修复应用提供更为可靠的实验依据.方法 将体外培养的BMSCs分为单纯血清培养组(FCS组)、PRP诱导组和DEX组,通过相差显微镜观察碱性磷酸酶(ALP)染色、钙盐沉积染色,RT-PCR法检测碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、Ⅰ型胶原(Coll-Ⅰ)、骨连接蛋白(ON)、中心结合因子(Cbfα1)mRNA表达系统评价PRP的成骨分化能力. 结果 PRP抑制了BMSCs向三角形、多角形细胞转变,DEX则诱导BMSCs向三角形、多角形细胞转变;PRP抑制了ALP分泌,钙盐沉积;DEX增加了ALP分泌,促进钙化结节形成.与FCS组相比,DEX促进了ALP、OCmRNA表达,PRP抑制了ALP、OC mRNA表达;PRP、DEX对Coll-Ⅰ、ON、Cbfα1 mRNA表达均无影响.结论 在本实验条件下,PRP对人BMSCs体外成骨分化的直接作用是抑制效应;在体外PRP并不能代替DEX作为人BMSCs成骨分化的诱导因子.     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

富含血小板血浆和骨髓基质干细胞复合物修复兔颅骨缺损

目的:在骨缺损中植入骨髓基质细胞和富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma, PRP)的复合物,观察缺损的修复情况,为临床骨缺损的修复探索新的途径。方法:体外扩增兔骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cell, MSCs),将MSCs与PRP混合形成MSCs/PRP复合物,使细胞的终浓度为5×106个/ml。将MSCs/PRP复合物用牛凝血酶固化为凝胶体,植入细胞供体兔颅骨直径15mm缺损中,以单纯植入PRP作为对照。术后8周取材,通过大体观察、X线检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果:MSCs/PRP凝胶植入8周后,缺损大部分获得修复,组织学分析显示缺损中有大量新骨形成。结论:应用PRP复合MSCs可以提高骨缺损的修复效果。     

骨髓基质干细胞在骨科应用研究的现状

骨髓基质干细胞（marrow stromal cells,MSCs） 是一类具有独特表型和细胞化学特性的细胞群,有自我复制和多向分化的潜能.将小鼠的MSCs置于体外特定条件诱导培养下,可向多种中胚层和神经外胚层来源的细胞分化,包括成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、成纤维细胞、神经细胞、上皮细胞、肝细胞和脂肪细胞等成熟细胞[1].     

成人骨髓基质干细胞的体外培养及初步诱导分化研究

目的:探讨体外培养人骨髓基质干细胞(BMSC)的方法和初步诱导BMSC向神经细胞方向分化的方法。方法:采用正常成人献髓者骨髓,分离扩增BMSC,原代培养后将传1～4代细胞按1×104/ml种于24孔板,绘制生长曲线、贴壁率,观察细胞生长及不同浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)对BMSC的作用。以全反式维甲酸(RA)和bFGF为诱导剂,观察诱导前后BMSC的变化。结果:原代BMSC生长状态良好,传至第5代仍保持干细胞特性,bFGF可明显促进BMSC增殖,且呈剂量依赖关系。RA和bFGF诱导12h,BMSC逐渐向神经样细胞转化,胞体收缩成锥形、三角形或不规则形,细胞伸出细长突起,免疫细胞化学鉴定呈Nestin阴性,NSE阳性,GFAP阳性,且NSE阳性细胞数较GFAP阳性为少。结论:BMSC可在体外稳定扩增,且能保持干细胞特性,RA和bFGF可诱导其分化为神经细胞。     

骨髓基质干细胞体外培养及临床应用研究

目的 :通过对人骨髓基质细胞的体外培养、扩增和初步回植的研究 ,探讨MSCs临床应用疗效和前瞻性。方法 :从人髂骨抽取骨髓液 ,体外培养、传代和扩增 ,细胞周期、细胞形态和细胞分裂方式观察 ,并初步对骨科疾病进行回植治疗。结果 :建立一套完整、简单、成熟的体外分离、培养、扩增MSCs的系统方法 ,获得初步良好的临床疗效。结论 :人骨髓基质细胞能在体外大量培养扩增 ,为今后的理论研究和临床应用奠定了基础     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的　研究人MSC诱导为成骨细胞后 ,其在脱钙骨上的粘附特性。方法　采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞 ,条件培养液诱导培养至第 3代细胞 ,经相差显微镜观察 ,钙结节茜素红染色 ,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白 ,RT -PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达。不同浓度细胞悬液接种脱钙骨 ,MTT计数未粘附细胞量 ,计算不同浓度下MSC的粘附率 ,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量。结果　MSC经体外诱导形成钙结节 ,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性 ,RT -PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达。脱钙骨上接种MSC达到饱和后 ,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降。单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为 3 .5×1 0 7/ g。 结论　人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型 ,在脱钙骨上有良好的粘附能力 ,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的研究人MSC诱导为成骨细胞后,其在脱钙骨上的粘附特性.方法采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞,条件培养液诱导培养至第3代细胞,经相差显微镜观察,钙结节茜素红染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白,RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.不同浓度细胞悬液接种脱钙骨,MTT计数未粘附细胞量,计算不同浓度下MSC的粘附率,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量.结果 MSC经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性,RT-PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.脱钙骨上接种MSC达到饱和后,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降.单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为3.5×107/g.结论人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型,在脱钙骨上有良好的粘附能力,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量.     

骨髓基质干细胞复合改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯体外构建组织工程化软骨

目的 探讨应用骨髓基质干细胞(BMSCs)复合光接枝改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯(PHBV)构建组织工程化软骨的可行性. 方法 将3代绵羊骨髓基质细胞接种于光接枝改性的三维PHBV支架材料上,24 h后以成软骨诱导液培养,3周后,复合培养物行扫描电镜观察,组织学观察,测定糖胺聚糖(GAG)含量.并将复合物埋植于绵羊腹部皮下,4周后取出,行大体及组织学观察. 结果 经成软骨诱导后,扫描电镜下,BMSCs的突触逐渐变短,由长梭形向扁平形转变,分泌基质量亦明显增多.组织学观察见细胞支架复合物阿利新蓝、番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性.GAG含量测定示诱导3周后,细胞分泌的GAG量(1306.7±192.3)明显高于未经诱导的BMSCs(205.0±26.2)(P<0.001),但仍低于正常软骨细胞(1969.2±235.3)(P<0.001).复合物埋植于皮下4周后,其内炎症细胞浸润明显,但番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性. 结论 以BMSCs为种子细胞,复合改性的PHBV,可于体外构建出软骨样组织,但该组织的理化特点与正常软骨仍有差距.     

骨髓基质干细胞及其在骨组织工程中的应用

骨髓基质干细胞（BMSCs）是一群存在于骨髓中的非造血干细胞,具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞等多种细胞.BMSCs的应用是目前国际上骨组织工程领域的重要研究内容,具有广泛的临床应用前景.近年来,许多实验室从分子、生化、物理等水平对其成骨分化调控进行了深入研究,取得了较大的进展.     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

低温保存对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上体外增殖及成骨能力的影响

目的研究低温保存对人骨髓基质干细胞(BMSCs)在脱钙骨(DBM)上生长特性及成骨能力的影响。方法取3例志愿者骨髓(3～5mL),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。第3代BMSCs在-196℃下保存24h,37℃复苏,测定细胞成活率。低温保存前、后的BMSCs分别用成骨诱导液诱导培养,至90%融合时,收集细胞接种在DBM支架上,并测定细胞在DBM上的粘附率。DiI荧光染料标记BMSCs,例置相差显微镜、荧光显微镜和SEM观察低温保存前、后的BMSCs在DBM上的生长及基质分泌情况,MTT法测定细胞在DBM上的增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞在DBM上的成骨能力。结果复苏细胞的存活率为(90．24±0．02)%。低温保存前、后的BMSCs在DBM上的粘附率分别为(97．25±1．17)%和(97．00±1．09)%。倒置相差显微镜及SEM观察显示低温保存前、后的BMSCs在DBM上粘附、生长良好,有大量细胞外基质分泌、沉积。低温保存前、后的BMSCs在DBM上MTT吸光度值和ALP活性的检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)；体外培养12d时,MTT吸光度值及ALP活性同时达到峰值。低温保存前、后的BMSCs在DBM上分泌OCN的量差异无显著性意义(P＞0．05),OCN含量随着培养时间延长而不断上升,在观察期(16d)内未出现平台期。结论低温保存对人BMSCs在DBM上的体外增殖、粘附及成骨能力影响差异无显著性意义,低温保存的人BMSCs可作为组织工程骨的种子细胞。     

联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨由骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的内皮细胞(EC)与自体BMSCs共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离兔BMSCs,培养细胞分为四组：A组(BMSCs组)、B组(BMSCs成骨诱导组)、C组(EC诱导组)及D组(BMSCs和诱导的EC联合培养组),通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨钙素含量从酶学、组织学及生化等不同方面观察诱导的EC对BM- SCs成骨活性及牛长情况的影响。结果细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。倒置相差显微镜、HE染色均显示EC与BMSCs混合生长良好。MTF检测结果：各组细胞增殖差异无显著性意义(P＞0．05)。碱性磷酸酶活性和骨钙素含量检测结果：D组明显高于其它各组,差异有显著性意义(P＜0．05)。结论由BMSCs诱导的EC能够增强BMSCs的成骨活性,提高BMSCs的增殖能力。     

体外诱导小鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化相关基因表达的研究

目的体外培养小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为成骨细胞,定量分析其骨生成关键标志基因的表达水平。方法体外培养小鼠BMSCs 7、14、21 d,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPIN)和骨唾液酸蛋白(BSP)基因的表达水平。结果小鼠BMSCs体外稳定增殖和分化,Ⅰ型胶原培养14 d和21 d mRNA水平分别是培养7 d时的0．75±0．04倍和(0．34±0．03)倍;ALP、OPN和BSP基因表达水平随着培养时间延长而上升,其中培养21 d时的ALP、OPN和BSP mRNA水平分别是培养7 d时的(19．70±2．36)倍、(150．12±9．31)倍和(7．73±0．58)倍。结论荧光定量RT-PCR可以灵敏地检测成骨细胞关键标志基因表达水平,随着培养时间延长,Ⅰ型胶原的表达水平逐渐下降,而ALP、OPN和BSP的表达水平显著上升。     

诱导骨髓基质细胞成血管平滑肌细胞的研究

目的 探讨体外诱导犬骨髓基质细胞(SMSC)为血管平滑肌细胞(VSMC)及其成血管的能力.方法 用含血小板源性生长因子(PDGF-BB)10ìg/L的内皮细胞培养液-2(EGM-2)诱导,无PDGF-BB的EGM-2培养液为对照,检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SM actin)与肌钙结合蛋白(calponin)的表达并接种于聚羟基乙酸(PGA)培养4周后取材.结果 诱导组(n=5)细胞逐步呈平滑肌样转变,表达a-SM actin与calponin,流式细胞仪阳性率分别为(45.16±0.97)%、(37.54 4±1.15)%,可成血管样结构,对照组(n=5)变化不明显,阳性率(7.92±1.04)%、(6.37±0.83)%,成血管样结构能力差.结论 体外可诱导犬BMSC为VSMC并有成血管样结构的能力.     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

大鼠组织提取液对体外培养骨髓基质细胞的影响

目的研究大鼠脑组织成份和其它组织提取液对体外培养骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSC)的影响。方法提取大鼠全脑、灰质、白质、垂体、肌肉、肝脏等组织液,进行原代骨髓基质细胞培养,观察并测定其ALP染色阳性率。以空白培养液作对照,观察大鼠各组织提取液对骨髓基质细胞增殖,分化,矿化的作用。结果(1)各组织提取液对原代骨髓基质细胞培养后,其ALP染色阳性率以灰质和全脑组最高,其次是白质和肌肉组。(2)除肝脏组外其余各组织提取液对BMSC均有不同程度的增殖刺激作用,以灰质最强,其它依次为肌肉、白质、全脑与血清组,肝脏组则显示对BMSC增殖有抑制作用。(3)肝脏组对BMSC具有分化抑制作用,其它各组均显示分化刺激作用,增加程度依次为灰质、全脑、白质、肌肉与血清。(4)灰质组的矿化结节形成率最高,其它依次为全脑、白质、肌肉与血清。结论大鼠脑组织中的灰质提取液能显著刺激原代骨髓基质细胞增殖,且向成骨细胞诱导分化,并且在二代以后的BMSC培养中,表现出最强的刺激增殖、向成骨细胞分化和体外矿化的能力。     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。