人PRKAG2(R302Q)突变型SD乳鼠心肌细胞模型的建立及检测

目的 包装人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒后感染原代SD乳鼠心肌细胞构建细胞模型。方法 首先通过BP及LR重组获得人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒表达载体,将其线性化转染293细胞进行腺病毒包装和扩增。收集纯化腺病毒液感染原代SD乳鼠心肌细胞后进行WB检测。结果 PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒载体经测序验证插入序列正确,腺病毒感染乳鼠心肌细胞后WB检测其过表达明显(P<0.05)。结论 包装人PRKAG2 (R302Q)突变型基因的腺病毒并成功感染SD乳鼠心肌细胞为进一步研究基因PRKAG2(R302Q)突变体的功能奠定了基础。     

过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的腺病毒构建

目的设计特异性标记过氧化物酶体的绿色荧光蛋白，构建腺病毒载体，并感染培养的大鼠心肌细胞H9C2，检测该腺病毒载体的表达效率，通过共聚焦显微镜观察细胞过氧化物酶体的分布，同时给予细胞缺氧处理，对比细胞内过氧化物酶体的变化。方法（1）设计带有过氧化物酶体信号肽序列的绿色荧光蛋白序列。（2）PCR扩增该序列片断，并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack中；pAdTrack经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组绿色荧光蛋白质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后，转染293A细胞，进行病毒包装，得到Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。（3）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒和不带有信号肽序列的Ad-GFP腺病毒感染培养的H9C2，24h后共聚焦显微镜下观察。（4）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染H9C2细胞后，分为正常培养和1%氧浓度培养两组，24h后观察。结果重组Ad-GFP-Peroxi腺病毒载体构建成功；与Ad-GFP腺病毒相比，Ad-GFP-Peroxi腺病毒能够特异性显示大鼠心肌细胞内过氧化物酶体的分布；且缺氧刺激后H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组的方法成功构建的过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的过表达腺病毒，对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率，共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况，且缺氧刺激导致过氧化物酶体分布聚集。     

miR-1在心肌细胞生长中的调节作用

[摘要] 目的 构建并鉴定microRNA-1(miR-1) 的腺病毒表达载体,并探讨其在心肌肥厚中的介导作用。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片段,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAd-precusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率,并分析心肌细胞表面积及肥厚标志物ANP(Nppa)、β-MHC(myh7)的基因表达变化。结果 基因测序及酶切鉴定证实重组Ad-precursor-miR-1腺病毒载体构建成功,腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平,减小心肌细胞表面积及Nppa、myh7的表达。结论 利用同源重组方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达,抑制心肌细胞生长。     

SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染

目的 采用HEK293细胞包装Ad-GFP-SHP-2和Ad-GFP-SHP-2-E76A并扩增Ad-GFP重组腺病毒并感染乳鼠心肌细胞.方法 纯化两种载体;Pac Ⅰ酶切线性化;线性化的载体转染入HEK293细胞进行包装;从病变的HEK293细胞分离重组腺病毒.利用重组的腺病毒感染乳鼠心肌细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结景 Pac Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶上显示有4.5 kb的条带;转染线性化的重组腺病毒载体人HEK293细胞中,反复冻融HEK293,其上清中含有重组腺病毒,当感染乳鼠心肌细胞感染复数为100时,感染效率大于90%.结论 成功包装重组腺病毒,包装后的腺病毒可高效感染乳鼠心肌细胞.     

白藜芦醇对H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤的保护机制研究

目的 研究白藜芦醇(Res)在H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤中的保护机制.方法 将原代培养的乳鼠心肌细胞分成3组:对照组,H2O2处理组和Res+ H2O2处理组,采用MTF比色法检测细胞活性,应用Real Time-PCR技术检测miR-34a的表达水平.结果 H2O2对乳鼠心肌细胞具有损伤作用,Res可明显缓解H2O2对乳鼠心肌细胞的损伤作用,经过H2O2处理后乳鼠心肌细胞内miR-34a的表达水平显著升高,Res可明显降低乳鼠心肌细胞内miR-34a的表达水平.结论 Res通过下调miR-34a的表达水平来发挥对H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤的保护作用.     

G蛋白参与K物质对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　观测 K物质对体外培养的乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度的影响 ,并探讨作用机制 .方法　应用钙离子荧光指示剂 Fluo- 3AM负载原代培养的大鼠心肌细胞 ,通过流式细胞仪检测心肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)变化 ;分别应用速激肽受体拮抗剂 - DSP和抗水解 GDP类似物 -GDPβS,观察二者对 K物质诱导的 [Ca2 + ]i变化的影响 .结果　 SK能升高 [Ca2 + ]i,即由对照组的 173± 2 0 nmol· L- 1升高至 2 84± 2 0 nmol· L- 1 (P<0 .0 1) ,且在 1.78× 10 - 5～ 1.78×10 - 7mol· L- 1 浓度范围内存有剂量 -效应关系 ;DSP和GDPβS均可阻断 SK诱导的心肌细胞 [Ca2 + ]i升高的效应 .结论　SK可升高心肌细胞 [Ca2 + ]i,其作用有 G蛋白参与     

参三七皂苷Rb1对缺氧复氧损伤心肌细胞[Ca2+]i含量和钙稳态的影响

目的:探讨参三七皂苷Rb1预处理对肥厚心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤游离钙([Ca2+]i)的影响及其与心肌细胞保护作用与关系。方法:采用体外培养乳鼠心肌细胞,血管紧张素I(IAngII)刺激形成肥厚模型,实验分为7组:①正常对照组(C);②肥厚细胞模型对照组;③肥厚细胞H/R损伤组(H+H/R);④-⑦:Rb1预处理(0.01～10μmol/L)+H/R组;用激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i以及对电压依赖和受体操纵性激动剂KCl,NE诱发细胞内钙离子变化的影响。结果:经缺氧2h复氧1h后,肥厚细胞H/R组[Ca2+]i荧光强度较对照组显著增高,Rb1预处理组细胞内[Ca2+]i荧光强度较肥厚细胞H/R损伤组显著降低(P<0.01)。Rb1预处理使KCl、NE诱发的细胞内钙荧光强度仅增加61.3%和78.9%,升幅显著下降(P<0.01)。结论:参三七皂苷Rb1预处理具有显著减轻H/R肥厚心肌细胞钙超载作用,是其细胞保护作用的重要机制。     

KCl和Iso对培养乳鼠单个心肌细胞游离钙浓度影响的研究

目的　测定培养大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i) ,观察KCl、异丙肾上腺素 (Iso)对心肌细胞 [Ca2 + ]i的影响 ,初步探讨其作用机制。方法　采用Fura - 2作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的心肌细胞 ,结合阳离子测定系统检测心肌细胞 [Ca2 + ]i。结果　静息时 ,心肌细胞 [Ca2 + ]i为 83 3±11 6 7nmol/L ,30mmol/L、 5 0mmol/L、 70mmol/LKCl使心肌细胞 [Ca2 + ]i升高 ,且呈剂量依赖性 ;同时10 μmol/L异丙肾上腺素使心肌细胞 [Ca2 + ]i升高。结论　Fura - 2 /AM结合阳离子测定系统可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度 ,KCl、异丙肾上腺素升高心肌细胞 [Ca2 + ]i的作用机制不同。     

骨形成蛋白4诱导大鼠H9c2心肌细胞肥大的作用机制

目的探讨骨形成蛋白4(BMP4)诱导大鼠H9c2心肌细胞肥大的作用机制。方法培养大鼠心肌细胞株H9c2,使细胞同步化。实验分2部分,第1部分取同步化的心肌细胞,加50μg·L-1BMP4 60μL进行干预,分别在干预后0、1、4、8、12、24 h检测磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)蛋白的表达;第2部分将同步化的心肌细胞随机分为对照组、BMP4组、BMP4+LY294002组及BMP4+3MA组。对照组细胞应用体积分数1%胎牛血清培养基培养;BMP4组细胞应用含50μg·L-1BMP4的体积分数1%胎牛血清培养基培养;BMP4+LY294002组细胞先应用25μmol·L-1的LY294002预处理120 min,再以含50μg·L-1BMP4的体积分数1%胎牛血清培养基培养;BMP4+3MA组细胞先应用10 mmol·L-1的自噬抑制剂3MA预处理120 min,再以含50μg·L-1BMP4的体积分数1%胎牛血清培养基培养。各组细胞给予BMP4 48 h后采用Image J软件测量细胞表面积。二喹啉甲酸法检测各组心肌细胞内蛋白含量。采用Western blot检测各组细胞给予BMP4 1 h后磷酸化磷脂酰肌醇3(P-PI3K)、P-Akt及自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达,给予BMP4 48 h后检测脑钠肽(BNP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果 BMP4作用心肌细胞0、1、4、8、12、24 h后P-Akt蛋白相对表达量分别为0.56±0.02、0.92±0.12、0.42±0.10、0.63±0.11、0.64±0.23、0.29±0.08,BMP4作用大鼠心肌细胞1 h后P-Akt蛋白相对表达量均高于其他时间点(P<0.05)。BMP4组大鼠心肌细胞表面积及总蛋白含量高于对照组(P<0.01);BMP4+LY294002组与对照组大鼠心肌细胞表面积及总蛋白含量比较差异无统计学意义(P>0.05);BMP4+3MA组大鼠心肌细胞表面积大于对照组(P<0.01),BMP4+3MA组与对照组大鼠心肌细胞总蛋白含量比较差异无统计学意义(P>0.05);BMP4+LY294002、BMP4+3MA组H9c2大鼠心肌细胞表面积及总蛋白含量均低于BMP4组(P<0.05);BMP4+LY294002组与BMP4+3MA组大鼠心肌细胞表面积及总蛋白含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。BMP4组、BMP4+3MA组大鼠心肌细胞内P-PI3K蛋白表达水平高于对照组,BMP4+LY294002组心肌细胞内P-PI3K蛋白表达水平低于对照组(P<0.01);BMP4、BMP4+3MA、BMP4+LY294002组大鼠心肌细胞内P-PI3K蛋白表达水平呈逐渐降低趋势,3组大鼠心肌细胞内P-PI3K蛋白表达水平两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。BMP4、BMP4+3MA组大鼠心肌细胞内P-Akt、LC3蛋白表达水平高于对照组(P<0.01),BMP4+LY294002组与对照组大鼠心肌细胞内P-Akt、LC3蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);BMP4+3MA、BMP4+LY294002组大鼠心肌细胞内P-Akt、LC3蛋白表达水平低于BMP4组(P<0.05);BMP4+3MA组与BMP4+LY294002组大鼠心肌细胞内P-Akt、LC3蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。BMP4组大鼠心肌细胞内α-SMA蛋白表达水平高于对照组(P<0.01),BMP4+3MA、BMP4+LY294002组与对照组大鼠心肌细胞内α-SMA蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);BMP4+3MA、BMP4+LY294002组大鼠心肌细胞内α-SMA蛋白表达水平低于BMP4组(P<0.05);BMP4+3MA组大鼠心肌细胞内α-SMA蛋白表达水平高于BMP4+LY294002组(P<0.05)。BMP4、BMP4+3MA组大鼠心肌细胞内BNP蛋白表达水平高于对照组(P<0.01);BMP4+LY294002组与对照组大鼠心肌细胞内BNP蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);BMP4+3MA、BMP4+LY294002组大鼠心肌细胞内BNP蛋白表达水平低于BMP4组(P>0.05)。结论 BMP4可能通过激活PI3K-Akt通路增加自噬活性,从而诱导大鼠H9c2心肌细胞肥大。     

异紫堇啡碱对培养乳鼠心肌内游离钙的影响

目的　观察异紫堇啡碱 (ISOC)对去甲肾上腺素 (NA)和高钾所致培养乳鼠心肌细胞内游离钙浓度([Ca2 + ]i)增高的影响 ,初步分析该药心脏效应的作用原理。方法　利用钙荧光指示剂Fura - 2 /AM负载的培养乳鼠心肌细胞 ,动态地观察在ISOC存在下 ,由NA和高钾所增加的 [Ca2 + ]i 改变。结果　ISOC对培养乳鼠心肌细胞的静息 [Ca2 + ]i 无影响 ,其在 10 -5和 3× 10 -5mol/L时也不显著抑制高钾所致心肌细胞 [Ca2 + ]i 的增高 ,但能降低由NA所升高的心肌细胞 [Ca2 + ]i。结论　ISOC抑制由受体中介的心肌细胞 [Ca2 + ]i 的增高     

线粒体融合蛋白Mfn2对心肌细胞肥大的抑制作用

目的:探讨线粒体融合蛋8-2(mitofusin 2,Mfn2)在心肌细胞肥大时表达的变化,及其对心肌细胞肥大的作用.方法:原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞用苯肾上腺素(phenylephrine,PE)10^-5moL/L处理,诱导心肌细胞肥大模型.采用RT-PCR和Western blot方法检测Mfn2基因在肥大心肌细胞中的表达.培养的心肌细胞感染含有Mfn2基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad Mfn2)或对照腺病毒Ad GFP后,给予PE刺激诱导心肌细胞肥大,采用3H-亮氨酸掺人法等方法评价过表达Mfn2对心肌肥大的影响.为了便于显示和分析,本研究将对照组的数据设为1,其他各组数据均为与对照组相比得到的相对数.结果:在PE诱导引起的肥大的心肌细胞中,细胞表面积增加约1倍(P<0.01),与不加刺激的对照组相比,心房利钠因子(atrial natriuretic fact,ANF)表达量也增加了约1倍(P<0.01),而Mfn2的mRNA水平(P<0.01)和蛋白质水平(P<0.01)均明显下降,分别为对照组的50%左右.AdMfn2转染后可检测到心肌细胞中Mfn2的过表达,与对照组Ad GFP(1.72±0.12vs2.47±0.06,P<0.05)相比过表达Mfn2能明显抑制PE引起的心肌细胞蛋白质合成量增加(0.98±0.10vs2.47±0.06,P<0.01)以及心肌细胞面积增大(1.530±0.008vs0.830±0.009,P<0.01).结论:在PE诱导的心肌细胞肥大模型中,Mfn2的基因水平与Mfn2蛋白水平表达明显降低,过表达Mfn2能抑制PE所引起的新牛大鼠心肌细胞蛋白质合成增加和心肌细胞表面积的增大.因此,Mfn2可能是参与心肌细胞肥大过程中的一个重要分子.     

腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用。结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布于心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MT...     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

肾上腺素致心肌细胞肥大的机制

目的：探讨肾上腺素致心肌细胞肥大中的机制。方法：在培养新生大鼠心肌细胞上,通过测量心肌细胞表面积和[^3H]—Leu的掺入量来判断心肌细胞肥大。结果：肾上腺素能明显增加心肌细胞表面积和[^3H]—Leu的掺入量,α受体阻滞剂(酚妥拉明)、β受体阻滞剂(心得安)、百日咳毒素(FIX)和蛋白激酶C(PKC)抑制剂(calphostin C)均可抑制肾上腺素诱导的心肌细胞表面积和[^3H]—Leu的掺入量增加。结论：肾上腺素诱导的心肌细胞肥大与肾上腺能受体(α受体和β受体)激动有关,并通过G蛋白和PKC介导。     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的改变

目的 :探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白 70表达的影响。方法 :第 2代培养心肌细胞随机分为正常对照组 (C组 )、缺氧 /复氧组 (A/R组 )、缺氧预适应组 (IP组 )和七氟醚预适应组 (S组 ) ,每组均缺氧 2h ,复氧 48h。分别取复氧 0 ,1,12 ,2 4,36和 48h的细胞 ,用免疫组化染色检测HSP70 表达并进行图象分析。结果 :在各个时间点 ,S组和IP组间的HSP70 表达均显著高于A/R组和C组 (P <0 .0 1) ,A/R组的HSP70 表达略高于C组 ,S组和IP组间的HSP70 表达差异无显著性 (P >0 .0 5 )。随着复氧时间的延长 ,S组和IP组间的HSP70 表达从 1h开始增加 ,2 4h表达最强 ,与 1h相比差异具有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70 在延迟相呈高表达 ,提示HSP70 参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

对比研究两种腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的转染效率及机制

目的 对比研究两种腺病毒载体Ad5/EGFP和AdF35/EGFP转染SD大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)的效率及其机制.方法 用密度梯度法从大鼠骨髓中分离出rBMSC,流式细胞仪检测其表面相关标志抗原(CD90、Cd29、CD44、CD34、CD11b和CD45)以鉴定rBMSC.用不同梯度感染复数(MOI)的Ad5/EGFP和AdF35/EGFP分别转染rBMSC,MTT检测二者对rBMSC生长的影响.转染后第1～9天,荧光显微镜下观察转染情况,同时流式细胞仪检测转染效率及平均荧光强度,实时PCR检测rBMSC表面CAR及CD46的表达水平.结果 rBMSC表达CD90、Cd29、CD44阳性,而CD34、CD11b、CD45表达为阴性.MOI≤1600时,Ad5/EGFP对rBMSC的生长无明显抑制作用(t=3.12,P=0.052);MOI≤1000时,AdF35/EGFP对rBMSC的生长无明显抑制作用(t=2.20,P=0.15)).荧光显微镜下,Ad5/EGFP转染rBMSC 1 d后即可见大量EGFP表达阳性的细胞,第2～3天阳性细胞数最多,随后减少,第9天仍可见少量的阳性细胞.AdF35/EGFP转染rBMSC后1～9 d EGFP阳性细胞数始终很少.Ad5/EGFP的转染效率显著性高于AdF35/EGFP的转染效率(t=2.45,P=0.008).经实时PCR检测,rBMSC高度表达CAR,而极低表达CD46,二者之间差异有统计学意义(t=2.57,P＜0.01).结论 Ad5/EGFP对rBMSC的转染效率明显高于AdF35/EGFP,这可能与rBMSC表面高表达CAR而极低表达CD46有关.AdF35不合适作为目的 基因转染rBMSC的载体,Ad5可作为目的 基因有效转染rBMSC的载体,这为后续目的 基因转染rBMSC治疗各种疾病的实验研究奠定了基础.     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP—70表达的改变

目的：探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白70表达的影响。方法：第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(A／R组)、缺氧预适应组(IP组)和七氟醚预适应组(S组)，每组均缺氧2h，复氧48h。分别取复氧0，1，12，24，36和48h的细胞，用免疫组化染色检测HSP70表达并进行图象分析。结果：在各个时间点，S组和IP组间的HSP70表达均显著高于A／R组和C组(P＜0．01)，A／R组的HSP70表达略高于C组，S组和IP组间的HSP70表达差异无显著性(P＞0．05)。随着复氧时间的延长，S组和IP组间的HSP70表达从1h开始增加，24h表达最强，与1h相比差异具有显著性(P＜0．05)。结论：七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70在延迟相呈高表达，提示HSP70参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

橙皮素对血管紧张素Ⅱ诱导H9C2心肌细胞肥大的影响

目的 探讨橙皮素对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导H9C2心肌细胞肥大的影响.方法 使用不同浓度橙皮素（0.125、0.25、0.5、1μmol/L）和AngⅡ（1μmol/L）共同孵育H9C2心肌细胞12h,心肌细胞骨架骨骼α肌动蛋白（α-actinin）荧光染色评估H9C2细胞面积改变以及real-time PCR方法检测心肌肥厚标志物BNP、β-MHC的mRNA表达变化,以观察不同浓度橙皮素对AngⅡ诱导H9C2心肌细胞肥大的影响,选择0.25 μmol/L橙皮素和AngⅡ（1μmol/L）共同孵育H9C2心肌细胞6、12、24h,观察橙皮素对AngⅡ诱导H9C2心肌细胞肥大抑制作用的时间相关性.结果 橙皮素干预可以缓解AngⅡ诱导H9C2心肌细胞的细胞面积增大;橙皮素抑制了AngⅡ诱导的H9C2心肌细胞BNP、β-MHC的mRNA表达水平升高.结论 橙皮素能够抑制AngⅡ诱导H9C2心肌细胞肥大,其有可能成为治疗心肌重构新的潜在药物.     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的 :探讨热休克预处理 (heatshockpretreatment,HS)对过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物 (thesecondmitochondria derivedactivatorofcaspases ,Smac)从线粒体释放的影响。方法 :①采用H2 O2 (0 .5mmol/L)导致心肌细胞凋亡 ;②采用热休克预处理 (4 2℃ ,1h ,恢复 12h)诱导热休克蛋白表达 ;③采用Hoechst荧光染色 ,观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率 ;④采用cas pase活性定量检测及Western blotting观察caspase 3,9的活化 ;采用免疫荧光及Western blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果 :①H2 O2 处理 2h ,Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆 ;处理 4hcaspase 3,9活性升高 ,12h达高峰 ;处理 2 4h心肌细胞明显出现凋亡 ,凋亡核百分率明显升高 ;②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90 ,HSP70及αB 晶状体蛋白的表达增高 ;抑制Smac释放、caspase 3,9的活化及细胞凋亡的发生。结论 :线粒体信号通路在H2 O2 所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用 ;热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2 O2 所致的细胞凋亡 ,其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase 3,9的活化有关。     

神经肽Y(NPY)诱导大鼠心肌细胞肥大的效应观察

目的 :观察神经肽Y(NPY)诱导大鼠心肌细胞肥大效应。方法 :用不同浓度NPY(10nmol/L、10 0nmol/L)刺激心肌细胞 ,应用3 H Leu掺入量法测定心肌细胞蛋白质合成速率、RT PCR法测心肌细胞c junmRNA表达。结果 :1.心肌细胞3 H Leu掺入量测定 :较大剂量NPY刺激心肌细胞蛋白合成速率显著增加。与对照组相比 ,NPY10nmol/L组3 H Leu掺入量有所增高 ,但差异无显著性 ,而NPY10 0nmol/L组心肌细胞 3H Leu掺入量较对照组明显增高 (P <0 .0 5 )。 2 .心肌细胞内c junmRNA表达 :NPY组心肌细胞c junmRNA的RT PCR产物量明显高于对照组(P <0 .0 0 1)。结论 :NPY刺激心肌细胞蛋白质合成增加、心肌细胞原癌基因 (肥大早期反应基因 )c junmRNA表达增加 ,提示NPY可通过其生长因子样效应 ,诱导心肌细胞肥大。