过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活北大核心CSCD

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

TRIM22稳定过表达细胞系的构建及其抗流感病毒的功能

目的构建稳定表达TRIM22的HEK293T细胞系HEK293T-TRIM22,观察TRIM22蛋白在该细胞内的表达及对流感病毒复制的影响并初步探究其抑制机制。方法扩增TRIM22基因并与反转录病毒载体进行体外重组连接,经菌液PCR、测序确认后与反转录病毒骨架载体共转染进HEK293T细胞进行包装病毒。用包装的反转录病毒感染HEK293T细胞,感染24 h后用嘌呤霉素筛选稳定过表达TRIM22的细胞,筛选48 h后用Western blot检测TRIM22表达水平;用IAV-LUC病毒检测稳定过表达TRIM22的HEK293T对流感病毒的抑制作用;再用双分子荧光互补实验(Bi LC)检测与TRIM22相互作用的流感蛋白。结果经测序确认目的基因TRIM22成功克隆到载体p QC-XIP中。包装反转录病毒并感染HEK293T细胞,经过嘌呤霉素筛选后,稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞中TRIM22的蛋白表达水平升高(P0.05)。在稳定过表达TRIM22的细胞内流感病毒复制减弱(P0.05)。Bi LC检测TRIM22与流感蛋白NP有相互作用。结论稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞系构建成功,TRIM22与NP有相互作用并且抑制流感病毒复制。     

上调人食管癌Eca109细胞Shh-Gli1信号通路对放射抗拒性及细胞周期的影响

目的:通过上调Sonic Hedgehog(Shh)信号通路关键因子Gli1,探究Shh信号通路与食管癌细胞放射抗拒性及细胞周期的关系。方法:用过表达Gli1质粒转染人食管癌Eca109细胞,记为Eca109-ox-Gli1组;转染空载质粒为阴性对照组;以不作处理的亲本细胞株为正常对照组。Real-time PCR与Western blot检测转染后细胞内Gli1的表达,集落形成实验检测细胞放射敏感性,流式细胞术检测转染前后细胞周期分布。结果:Real-time PCR与Western blot结果均显示Eca109-ox-Gli1组的Gli1表达显著高于阴性对照组和正常对照组(P0.05)。集落形成实验显示2 Gy射线照射后,Eca109-ox-Gli1组的存活分数较正常对照组明显升高(P0.05),转染后细胞对射线敏感性降低,放射抗拒性增加。Eca109-ox-Gli1组中S期细胞分布比例显著高于对照组(P0.01),再照射6Gy后,3组细胞均出现了G_2/M期阻滞,正常对照组相比于Eca109-ox-Gli1组G_2/M期细胞分布显著增高(P0.01)。结论 :上调Shh信号通路关键因子Gli1能够增强食管癌细胞的放射抗拒性,这一过程可能是通过调控细胞周期实现的。     

RNA干扰沉默增殖诱导配体基因对结肠癌细胞周期的影响

目的 探讨沉默增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因对人结肠癌SW480细胞增殖及细胞周期的影响.方法 将APRIL基因的小干扰RNA质粒载体(siRNA-APRIL)转染结肠癌SW480细胞株,以非特异性序列载体转染组(nontargeting control)及未转染组(nontransfected control)作为对照.Real-time PCR和Western blot评价APRIL沉默效率;CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化;RT-PCR检测细胞周期调控基因p21及p27的表达.结果 与非特异性序列载体转染组及未转染组相比,siRNA-APRIL显著抑制APRIL mRNA及蛋白的表达(P＜0.05);siRNA-APRIL转染SW480细胞48 h、72 h和96 h后细胞增殖能力明显下降(P＜0.05);转染48 h,siRNA-APRIL组G0/G1期细胞比例增高,S期及G2/M期细胞比例减少,细胞凋亡的数量增加,同时p21及p27 mRNA的表达上调(P＜0.05);而上述指标两对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 siRNA-APRIL能特异性抑制结肠癌SW480细胞APRIL的表达,并抑制细胞增殖,使细胞周期出现G0/G1期阻滞,其机制可能与上调p21和p27的表达有关.     

microRNA-218在急性淋巴细胞白血病细胞CCRF-CEM中的作用及机制研究

目的:检测microRNA-218(miR-218)在人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中的表达情况和其对细胞生物学特性的影响,并观察miR-218对靶基因c-kit表达的影响,为人白血病治疗提供新方法和新策略。方法:利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测miR-218在正常人外周血T淋巴细胞和CCRF-CEM中的表达情况。在CCRF-CEM细胞中转染miR-218 mimic后48 h,qRT-PCR检测CCRF-CEM细胞中miR-218表达变化;MTT检测miR-218对CCRF-CEM细胞活力的影响。流式细胞仪分析miR-218对细胞CCRF-CEM的细胞周期和凋亡的影响。利用荧光报告酶系统检验c-kit是miR-218调控靶基因,并采用Western blot方法检测miR-218对CCRF-CEM细胞中KIT蛋白表达的影响。结果:qRT-PCR检测结果显示:与正常人外周血T淋巴细胞相比,miR-218在CCRF-CEM细胞系中的表达显著下降(P0.01)。与对照组相比,在CCRF-CEM中转染miR-218 mimic 48 h后,细胞中miR-218的表达显著上升(P0.01)。MTT结果显示:在CCRF-CEM细胞中过表达miR-218后,细胞活力显著下降(P0.05)。流式细胞仪分析结果显示:过表达miR-218后,miR-218mimic转染组细胞的S期细胞比例明显下降(P0.01);细胞的凋亡显著增加(P0.01)。荧光素酶报告基因系统检测结果显示:与对照组相比,转染miR-218 mimic组的相对荧光素酶活力显著降低(P0.01)。Western blot检测结果显示:与对照组相比,在CCRF-CEM中转染miR-218 mimic 48 h后,细胞中KIT蛋白的表达显著下降(P0.01)。结论:miR-218在人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中表达下调,miR-218可负性调节KIT蛋白的表达,并抑制CCRF-CEM细胞增殖,促进凋亡。增强miR-218表达的治疗策略有望使白血病患者受益。     

TRIM69可抑制紫外线和依托泊苷刺激时HeLa和HEK293T细胞系内活化型caspase7和剪切型PARP的表达

目的验证TRIM69蛋白是否能够抑制He La和HEK293T细胞系内活化型caspase7(cleaved caspase7)和剪切型PARP(cleaved PARP)的蛋白水平。方法构建含人源TRIM69的真核表达质粒,转染He La细胞和HEK293T细胞,筛选稳定表达TRIM69的细胞系,通过紫外线照射和凋亡诱导剂依托泊苷(etoposide)刺激处理,Western blot检测细胞内TRIM69蛋白、活化型caspase7和剪切型PARP蛋白水平的变化。结果紫外线照射和依托泊苷刺激后,与对照组相比,TRIM69过表达的细胞内活化型caspase7和剪切型PARP的蛋白水平均下降(P0.05)。结论TRIM69蛋白的表达可抑制紫外线或依托泊苷刺激时He La和HEK293T细胞内凋亡相关蛋白活化型caspase7和剪切型PARP的蛋白水平。     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

Tau蛋白过度表达促进细胞重新进入细胞周期

目的 探讨tau蛋白过度表达对细胞重新进入细胞周期的影响.方法 采用免疫印迹和免疫荧光细胞化学的方法,分别检测稳定转染质粒peDNA3.1-tau和空载体pcDNA3.1的HEK293细胞(HEK293/tau和HEK293/vec)中tau的表达,用细胞周期抑制剂Aphidicolin处理细胞抑制细胞周期,在Aphi...     

UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进H3K9乙酰化抑制细胞增殖

目的探讨UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中对H3K9乙酰化及细胞增殖的影响。方法体外培养HEK293细胞,构建羟基脲所致的DNA损伤细胞模型;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒,用Western blot评估p CMV-3×Flag-UHRF2转染效率及H3K9乙酰化水平;CCK8法检测HEK293细胞增殖。结果 HEK293细胞经2.5 mmol/L羟基脲处理12 h后,DNA出现了明显的损伤;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒后,UHRF2蛋白表达显著升高(P0.01);DNA损伤应答中H3K9乙酰化显著增加(P0.05);细胞增殖能力明显下降(P0.05)。结论 UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进组蛋白H3K9乙酰化抑制细胞增殖。     

siRNA沉默LBH基因促进人支气管上皮细胞周期进展

目的: 利用合成的小分子干扰RNA(siRNA)转染人支气管上皮细胞16HBE,观察LBH(limb-bud and heart) 基因表达下调对16HBE细胞周期及相关基因表达的影响。方法: 脂质体2000转染靶向LBH 基因的siRNA到16HBE细胞,荧光定量RT-PCR检测siRNA转染后LBH基因表达,流式细胞术检测LBH基因沉默后16HBE 细胞周期的改变,荧光定量RT-PCR及Western blotting检测LBH基因沉默后细胞周期素E1和E2表达水平。结果: 50 nmol/L siRNA转染16HBE细胞48 h后, LBH基因的表达水平只有对照组的14%;siRNA转染16HBE细胞48 h,其G₁期细胞百分率比对照组减少9.28%,而S期细胞百分比增加14.08%;16HBE细胞在50 nmol/L siRNA的转染后,细胞周期素E2的表达水平为对照组的2倍,而细胞周期素E1的表达没有发生明显改变。结论: 靶向于LBH基因的siRNA能有效沉默16HBE细胞中LBH基因的表达,LBH基因的表达下调促进了16HBE细胞周期G₁/S期的进展;细胞周期素E2的表达上调参与了LBH沉默导致的细胞周期G₁/S期的进展。     

褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响。方法:将HSC-T6细胞分为空白对照组、阴性对照组及药物组,用不同浓度的褐藻素培养HSC-T6细胞。采用CCK-8检测在24 h、48 h和72 h褐藻素对HSC-T6细胞活力变化的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot法分别检测Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:与空白对照组相比,CCK-8检测的结果表明,褐藻素在一定浓度范围内(15~75μmol/L)内能显著抑制HSC-T6细胞的活力(P0.01),呈剂量和时间依赖性。流式细胞术结果显示,24 h后高浓度(60μmol/L)组对HSC-T6细胞周期影响的效果显著(P0.01),G_1期比例显著下降(P0.01),G_2期和S期的比例显著升高(P0.01),48 h后低浓度(15μmol/L)和中浓度(30μmol/L)组对HSC-T6细胞周期的阻滞作用增强,呈剂量依赖性(P0.05);低、中、高浓度组早期凋亡率和总凋亡率都显著升高,呈剂量依赖性(P0.05)。蛋白印迹法实验结果表明,低、中、高浓度组Bax的蛋白表达显著上调,中、高浓度组Bcl-2的蛋白表达显著下调(P0.05)。结论:褐藻素可以通过使细胞周期阻滞于S期和G2期而抑制HSC-T6细胞生长;同时能通过下调Bcl-2和上调Bax的表达而诱导HSC-T6细胞凋亡。     

HEK293T细胞表达的单核细胞趋化蛋白1促进巨噬细胞迁移

目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)真核表达载体,转染人胚肾HEK293T细胞,验证其对巨噬细胞的趋化作用。方法小鼠基因组DNA作模板,用PCR法获得MCP-1启动子区基因片段,插入p FLAGCMV1载体。用双酶切法和测序鉴定正确后,将构建好的病毒载体转染HEK293T细胞,用Western blot法检测MCP-1的表达,用Transwell~(TM)实验检测转染后细胞分泌的MCP-1对巨噬细胞的趋化作用。结果重组载体酶切鉴定在相应位置有目的片段,转染单核细胞趋化因子重组载体后的HEK293T细胞有MCP-1表达,转染后HEK293T细胞分泌的MCP-1明显增加巨噬细胞的迁移。结论HEK293T细胞表达的MCP-1明显增强巨噬细胞的迁移。     

可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达

目的构建CD20真核表达载体,在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白。方法以人外周血单个核细胞(PBMC总RNA为模板,反转录PCR扩增得到CD20基因,并插入真核表达载体p CMV3-C-His,PCR初步验证后,再测序验证。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达,ELISA、Western blot法检测CD20蛋白表达,优化表达条件。结果 PCR与测序均显示成功插入CD20基因。转染HEK293T细胞72 h后,Western blot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白。HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关。结论成功构建CD20真核表达载体,高效表达CD20可溶性蛋白。     

敲降ZEB1基因表达对人脂肪间充质干细胞增殖、周期与凋亡的影响

目的探讨敲降ZEB1基因表达对人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)增殖、周期和凋亡的影响。方法胶原酶消化法提取人脂肪组织中原代间充质干细胞,对其进行免疫学表型、成骨和成脂分化能力鉴定后用于实验。脂质体转染法将siRNA转入h ADSCs,实时定量PCR和Western blot检测ZEB1、细胞增殖、周期和凋亡相关基因mRNA和蛋白的表达。MTS法检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果与si-NC转染组相比,si-ZEB1转染组可使ZEB1 mRNA和蛋白表达水平降低(P0.01),细胞增殖能力明显下降(P0.05),增殖相关基因CCND1、MKI67、MYC和PCNA表达显著下调(P0.05或P0.01);G1期细胞比例从50.71%增加到58.94%(P0.01),S期和G2期细胞比例分别减少了6.16%和2.07%;细胞凋亡率上升了10.2%,促凋亡相关基因TP53和BAX表达上调,抗凋亡基因MCL1和BCL2表达下调(P0.05或P0.01)。结论 ZEB1具有促进h ADSCs增殖和周期进展,抑制细胞凋亡的作用。     

早期生长反应基因-1的表达与射线诱导胶质母细胞瘤凋亡的相关研究

目的 研究Egr-1基因在胶质母细胞瘤细胞放射前后的表达变化和放射敏感性的研究.方法 培养人恶性神经胶质母细胞瘤(GBM)细胞系T98G,分别提取4Gy剂量射线照射前及照射后不同时间点细胞的总RNA,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测Egr-1表达水平;.收获4Gy剂量射线照射后0、4、8、12、24和36h的细胞,采用细胞增殖抑制实验,及流式细胞术进行细胞周期和细胞凋亡检测.结果 T98G细胞在照射后Egr-1表达水平与对照组比较有显著差异(P =0.017);T98G细胞在射线照射后的生长抑制率与对照组比较有显著差异(P=0.026);射线照射后0、4、8、12 h细胞S期比例逐渐减低,G0/G1期比例逐渐升高,并在照射后12 h达到峰值,G2/M期无明显变化,照射后12、24、36 h细胞S期比例逐渐升高,G0/G1期比例逐渐减低,G2/M期无明显变化,各组之间相比,差异有统计学意义(P=0.035).射线照射后0、4、8、12h细胞凋亡率逐渐升高,并在照射后12 h达到峰值,照射后12、24、36 h细胞凋亡率逐渐降低,各组之间相比,差异有统计学意义(P =0.019).结论 通过射线诱导Egr-1基因表达而引起细胞周期和细胞凋亡的变化;射线诱导的Egr-1基因表达水平与射线诱导的细胞凋亡成正相关.     

shRNA干扰PLCε1基因对人食管癌Eca109细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞增殖和细胞周期的影响及其可能的机制。方法 PLCε11、PLCε12和PLCε13质粒表达载体用于沉默PLCε1,通用阴性对照质粒表达载体HK作为对照。用阳离子脂质体进行转染,筛选出干扰效果最好的质粒表达载体(PLCε12)。实验分为Eca109组、HK组和PLCε12组。MTT检测细胞的存活率。FCM检测细胞周期,RT-PCR检测细胞P16、Cyclin D1基因mRNA表达。结果 HK、PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞后48和72 h,PLCε12组Eca109细胞的存活率分别为80.73%和75.88%,显著低于HK组(P0.001)。Eca109细胞转染后24 h,PLCε12组处于S期的细胞比例明显低于HK组(P0.01),细胞周期阻滞于G0/G1期。质粒表达载体转染Eca109细胞48 h后,PLCε12组Eca109细胞P16基因mRNA表达水平明显高于HK组(P0.01)。结论沉默PLCε1基因可能通过上调Eca109细胞P16基因的表达,阻止细胞周期从G1期向S期的过渡,抑制Eca109细胞的增殖活性。     

聚乙烯亚胺介导三质粒共转染HEK293细胞的条件优化

本研究用聚乙烯亚胺(PEI)介导表达绿色荧光蛋白(GFP)的rAAV包装系统(pAAV-CMV-GFP、pAAVRC和pHelper)转染人胚肾293细胞(HEK293细胞)。用ImagePro Plus6.0图像分析软件计算表达GFP的细胞比例来测定1、2、3、4、5、6μg/孔不同质粒剂量,1∶1、3∶1、5∶1、7∶1不同PEI/质粒比值及转染12、24、36、48、60、72h不同时间三个变量对转染效率的影响,以优化PEI介导三质粒共转染HEK293细胞的条件。结果显示,质粒剂量为4μg/孔、PEI/质粒比值为3∶1~5∶1时转染效率维持较高水平;转染效率-转染时间曲线为S型增长曲线,转染效率于60h达到平台期。优化PEI转染条件能增加三质粒共转染HEK293细胞的转染效率。     

克隆的BKCa通道介导AngⅡ诱导的HEK293细胞增殖

目的:探讨BKCa通道在AngⅡ诱导细胞增殖过程中的调控作用.方法:以脂质体转染法将人源性BKCa通道α亚基(hSloα)转染到HEK293细胞中(HEK293-hSloα), 用MTT法测定AngⅡ诱导细胞增殖的量效曲线, 用免疫细胞化学方法、流式细胞术分别观察AngⅡ、 IBTX及AngⅡ+IBTX对HEK293-hSloα细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达和细胞周期的影响.结果:AngⅡ可剂量依赖性诱导HEK293-hSloα细胞增殖, AngⅡ促进HEK293-hSloα细胞PCNA表达, 并使S期细胞比率增加.但此作用能被BKCa通道特异性抑制剂IbTX所阻断.结论:BKCa通道可介导调节AngⅡ诱导的HEK293-hSloα细胞增殖过程.     

小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响

目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。