鱼腥草注射液诱导人肺腺上皮细胞β防御素2mRNA表达

目的：探讨鱼腥草注射液体外刺激人肺腺上皮细胞（SPC—A—1）后人β防御素2（human beta—defensin 2，HBD-2）基因表达的情况，并研究HBD-2表达对鱼腥草注射液浓度和作用时间的依赖效应。 方法：体外培养SPC—A—1细胞，设置12．5、25、50、100和200 μg／ml 5个鱼腥草注射液浓度梯度，刺激贴壁生长的SPC-A-1细胞8h，根据细胞HBD-2 mRNA表达量明确作用最佳的浓度；最佳作用浓度鱼腥草注射液作用0、1、2、4、8、16、24和48h，根据细胞HBD-2 mRNA表达量明确最佳作用时间。SPC—A-1细胞HBD-2 mRNA表达的情况应用逆转录聚合酶链式反应技术检测。 结果：不同浓度鱼腥草注射液刺激SPC—A-1细胞后，HBD-2表达与刺激剂量（rs=0．829，P=0．042）和刺激时间（rs=0．914，P=0．003）具有一定的相关性，当鱼腥草浓度为100 μg／ml、刺激8h时，HBD-2 mRNA表达水平达到最高。与空白对照组和白细胞介素1β对照组比较，100μg／ml鱼腥草注射液作用8h可以上调SPC—A-1细胞HBD-2 mRNA的表达。 结论：鱼腥草注射液可诱导HBD-2基因的表达增强，最佳浓度为100μg／ml，最佳刺激时间为8h。     

板蓝根诱导人肺腺上皮细胞β-防御素-2基因表达的研究

目的 研究板蓝根体外刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)是否诱导表达具有抗菌活性的人-β-防御素-2(HBD-2)表达,并进一步探讨该表达是否存在浓度和时间依赖性效应,为进一步在动物水平探讨HBD-2的表达与中药之间的量效关系及时效关系提供依据.方法 体外培养SPC-A-1细胞,设置板蓝根5个浓度梯度,另设阳性对照和空白对照各1个,分别刺激贴壁生长的SPC-A-1细胞,应用RT-PCR技术检测SPC-A-1细胞HBD-2mRNA的表达情况,获取最佳表达浓度;再以最佳浓度经不同时间点刺激SPC-A-1细胞,得到表达诱导时间和持续时间.结果 研究显示板蓝根能够上调(SPC-A-1)细胞HBD-2mRNA的表达,且这种表达与板蓝根具有浓度和时间依赖性,当浓度为100μg/ml,刺激8h时,HBD-2mRNA的表达达到最高.结论 板蓝根可诱导HBD-2基因的表达,当浓度为100μg/ml,刺激8h时,其表达达到最高.     

脂多糖及前炎症细胞因子诱导人原代气道上皮细胞β防御素-2表达的实验研究

目的观察脂多糖（LPS）及前炎症细胞因子白细胞介素1w（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导人原代气道上皮细胞人β防御素-2（hBD-2）的表达,探讨呼吸道先天性病原体防御机制。方法LPS、IL-1β及TNF-α刺激培养人原代气道上皮细胞后,RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达,Westernblot和免疫组化法检测hBD-2mRNA蛋白的表达。结果正常人原代上皮细胞有微量hBD-2mRNA表达,不同质量浓度的12S、IL-1β及TNF-α刺激细胞后,hBD-2mRNA表达呈剂量依赖性增加,与对照组差异显著。0．1μg／mL的LPS、1ng／mL的IL-1β和10ng／mL的TNF-α刺激上皮细胞4h后,细胞均可见hBD-2蛋白表达。结论一定剂量的12S及前炎症细胞因子可诱导人气道上皮细胞hBD-2表达,且诱导hBD-2表达时间较短,hBD-2的表达可能是气道最初的防御反应。     

白介素-22诱导肺泡上皮2型人β防御素表达的初步研究

目的:初步探讨对于直接或间接引起的肺内感染,炎症反应产生的白介素(IL)-22能否刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,并且诱导其生成?释放2型人β防御素(human β-defensin-2,HBD-2)发挥抗感染作用?方法:流式细胞术检测肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞膜表面IL-22R表达水平?重组人IL-22(20 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,RT-PCR检测不同时间(0?2?4?8?16?24 h)HBD-2表达情况?不同浓度的重组人IL-22(0?4?20?100?500 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,RT-PCR检测HBD-2表达情况?结果:肺泡Ⅱ型上皮细胞膜表面IL-22R表达呈强阳性,阳性率达(99.90 ± 0.13)%?比较6个时间点HBD-2表达差异,发现HBD-2表达具有时间依赖性?比较不同浓度IL-22处理下HBD-2表达差异,IL-22 100 ng/ml为最佳干预浓度,且HBD-2表达与IL-22浓度具有依赖关系?结论:IL-22能显著诱导肺泡上皮细胞生成并释放HBD-2,且具有时间和剂量依赖性?     

人β防御素-2研究进展

内源性抗生素肽(endogenous antibiotic peptides)是动、植物天然免疫的重要介质,在哺乳动物(包括人)中,由于对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、螺旋体、分枝杆菌及某些包膜病毒等均有很强杀伤活性,故将其命名为防御素(defensin).迄今为止,在人体中已发现的防御素共有两类(α、β)10种.其中β防御素家族共发现3种,分子量为4～5kD,含38～47个氨基酸残基阳离子,分别为人β防御素-1,2,3(human β-defensin-1,2,3. hBD-1,2,3).德国Harder J等[1]于1997年首先发现hBD-2,他们用大肠杆菌亲和柱结合高压液相层析法在牛皮癣病人皮肤中分离并纯化到约4.3kD的多肽,经氨基酸序列分析表明与牛的TAP(气管抗菌肽)、LAP(舌抗菌肽)及hBD-1同源,属于人β抗菌肽成员之一,命名hBD-2.已证实hBD-2是黏膜和上皮细胞抵抗微生物入侵的重要介质,在持续暴露在病原微生物的器官表面发挥重要的抗菌作用.     

重组人β防御素2在膀胱上皮细胞中的表达及活性检测

目的探讨重组人β防御素2(hBD2)真核表达载体在人膀胱上皮细胞中的表达,并观察重组hBD2的体外抗菌活性。方法采用脂质体转染法将hBD2重组真核表达质粒pCAGG-hBD2导入无血清培养的人膀胱上皮细胞株T24细胞,利用RT-PCR法、Western blotting分别在核酸水平及蛋白质水平检测hBD2的表达。ELISA测定培养上清中hBD2的浓度,菌落计数法检测上清对尿路致病性大肠杆菌(UTI89)和克雷白杆菌(TOP52)的临床分离株的抗菌效果。结果 RT-PCR和Western blotting结果显示,转染后hBD2可在T24细胞中有效地表达。上清中hBD2的含量为(36.5±3.2)ng/106个细胞,菌落计数法显示,hBD2对UTI89和TOP52临床分离株有显著的杀菌作用。结论 hBD2重组真核表达载体脂质体法转染人膀胱上皮细胞后,可高效表达具抗菌活性的基因重组hBD2。     

人β-防御素-2在慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中的表达

目的测定慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者诱导痰中人β-防御素-2（hBD-2）的表达水平，来探讨hBD-2在COPD中的可能作用。方法收集COPD急性加重期、稳定期患者及正常人的诱导痰各10例，处理后分别进行痰细胞的计数和分类，Western blotting analysis法检测诱导痰中hBD-2的表达水平，并以图文分析系统进行灰度的半定量对比，同时用ELISA法测定诱导痰中白细胞介素-1β（IL-1β）的表达水平，并与hBD-2的表达进行相关分析。结果与正常组比较，COPD急性加重期组和稳定期组的中性粒细胞比例明显增多（P〈0．01），而COPD急性加重期组和稳定期组的hBD-2蛋白表达灰度值明显降低，差异有显著性（P〈0．001）；与稳定期组比较，COPD急性加重期组hBD-2蛋白表达灰度值也明显降低，差异有显著性（P〈0．01）。COPD稳定期组的IL-1β表达与正常组比较升高，差异有显著性（P〈0．001）；与COPD稳定期组比较。COPD急性加重期组IL-1β表达明显升高，差异有显著性（P〈0．01）。hBD-2的蛋白印迹的灰度值与IL-1β的浓度呈显著负相关（r=-0．689，P〈0．01）。结论COPD患者诱导痰中hBD-2表达增高，并与IL-1β有相关性，提示hBD-2可能参与了COPD的炎性过程。     

卡介苗增强人β-防御素-1基因在肺腺上皮细胞表达的分子调节机制

目的 研究人β-防御素-1(hBD-1)基因启动子结构及卡介苗胞壁蛋白增强其mRNA在肺腺上皮细胞(SPC-A-1)中表达的转录调控机制。方法 hBD-1基因5′-端上游序列被连接入无启动子的pEGFP-1质粒和pCAT basic质粒，构建了系列5′-端缺失的pEGFPhBD-1及pCAT hBD-1报告质粒．pEGFP hBD-1质粒转染细胞后用荧光倒置显徽镜观察绿色荧光表达强度。pCAThBD-1报告质粒和pSV-β-Galactosidase control质粒(内对照)共转染SPC—A-1细胞后，给予卡介苗胞壁蛋白活性组分刺激，用ELISA检测CAT和β-Gal浓度．结果 hBD-1基因上游-314段有较强的启动子活性，-69段则启动活性减弱IBCG刺激后，即使上游序列缩短至-69位点时，报告基因CAT相对表达量仍明显增高。该区域有-同源性极高的C／EBPβ(CCAAT／Enhancer—binding proteinp)结合元件．结论 hBD-1基因上游-314bp段具有较完整的启动子活性，其中含有C／EBPβ结合位点的-69／ 54bp序列介导卡介苗对hBD-1基因转录的增强作用。     

阿霉素中毒大鼠肺组织中β-防御素-2的基因表达

目的:探讨阿霉素(adriamycin,ADM)所致大鼠急性肺损伤对肺组织β-防御素-2(BD-2)基因表达的影响。方法:雄性SD大鼠40只,随机分成ADM低剂量组(10 mg/kg)、中剂量组(20 mg/kg)、高剂量组(40 mg/kg)及对照组,每组10只。模型组分别一次性腹腔注射不同剂量ADM制备急性肺损伤模型;对照组用生理盐水腹腔注射。3天后剖胸取肺,采用半定量RT-PCR技术检测肺组织BD-2 mRNA表达的变化。结果:ADM中、高剂量组大鼠BD-2基因表达均较对照组明显上调(P<0.01),低剂量组与对照组无统计学意义(P>0.05)。结论:ADM所致大鼠急性肺损伤中,肺组织BD-2的mRNA表达水平上调。     

卡介苗诱导人肺腺上皮细胞hBD—1 mRNA的增强表达

使用热灭活的卡介苗刺激培养的人肺腺上皮细胞（ＳＰＣ－Ａ－１）,利用逆转录聚合物酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,证实了卡介苗能诱导ＳＰＣ－Ａ－１细胞β－防御素－１基因（ｈＢＤ－１）的增强表达。卡介苗菌量和刺激时间与ＳＰＣ－Ａ－１细胞ｈＢＤ－１基因表达量的关系曲线显示,ｈＢＤ－１ ｍＲＮＡ在人肺腺上皮细胞的增强表达在一定范围内表现为具刺激剂量和时间依赖关系。实验为开发增强粘膜抗菌     

牙龈上皮β-防御素-2诱导表达的中药筛选

目的 筛选出对大鼠牙龈上皮β-防御素-2具有诱导表达作用的中药。方法 2019年2月至2020年4月选取90只大鼠作为研究对象。将90只健康成年Wistar大鼠随机分为固有表达组(10只)、阴性对照组及阳性对照组(各10只);实验组分别给予药物(黄芪组、板蓝根组、丹参组、柴胡组、鱼腥草组、穿心莲内酯组,每组10只,共60只),连续给药7 d后将大鼠处死,切取大鼠牙龈上皮,采用免疫组织化学方法检测大鼠牙龈上皮β-防御素-2蛋白的表达情况。结果 黄芪组和板蓝根组大鼠牙龈上皮β-防御素-2蛋白的表达明显高于固有表达组,差异有统计学意义(P0.05),但与阳性对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 中药黄芪和板蓝根能够诱导大鼠牙龈上皮β-防御素-2的表达增高,黄芪和板蓝根具有调节大鼠口腔黏膜天然免疫的作用。     

17β-雌二醇通过ERK1/2途径诱导绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1的表达

目的 探讨17β-雌二醇(E2)对输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)mRNA基因表达的影响以及相关信号通路作用机制.方法 利用10-8 mol/L E2培养绵羊输卵管上皮细胞6 h,分别添加MAPK/ERK1/2信号通路阻断剂和PI3 K信号通路阻断剂,通过RT-qPCR技术检测SBD-1 mRNA的表达变化....     

白细胞介素-10对人外周血白细胞β-防御素2基因诱导性表达的影响

目的:探讨炎症抑制因子白细胞介素-10(白介素-10)在β-防御素2(hBD-2)基因诱导性表达中的作用。方法:22例健康人被纳入本研究中,以终浓度0 ng/m l的LPS、100 ng/m l的LPS、10ng/m l的IL-10、100 ng/m l的LPS+10 ng/m l的IL-10加入900μl人外周血中,于37℃刺激培养6 h后,提取外周血白细胞总RNA,用实时定量RT-PCR的方法测定外周血白细胞hBD-2mRNA的表达水平。结果:0 ng/m l的LPS或10 ng/m l的IL-10刺激6 h的白细胞中未检测到hBD-2 mRNA,100 ng/m l的LPS刺激6 h后hBD-2mRNA的表达水平为166.9±35.14,而IL-10与LPS共同刺激6 h后hBD-2 mRNA的表达水平为30.40±9.18。IL-10使hBD-2mRNA的诱导性表达水平明显降低(P<0.05)。结论:人外周血白细胞中hBD-2基因呈现诱导性表达,IL-10能下调hBD-2的诱导性表达。     

人防御素α5、人防御素β2在不孕患者输卵管的表达及意义

目的 通过分析粘连、闭锁的输卵管伞和正常输卵管伞中人防御素α5(human α defensin-5,HαD-5)、人防御素β2(human β defensin-2,HβD-2)的相关性,初步探讨HαD-5和HβD-2在输卵管伞粘连发生中的作用与意义,为临床防治输卵管伞粘连闭锁引起的不孕提供新的思路.方法 收集临床手术切除的输卵管伞组织,将输卵管伞分为粘连组(30例)和非粘连组(30例),应用免疫组化SP法检测HαD-5 和HβD-2的表达情况,分析二者的相关性.结果 免疫组化染色结果显示HαD-5、HβD-2两种因子在粘连组的表达强于不粘连组,且差异有统计学意义(P<0.05).不粘连组中HαD-5和HβD-2的表达呈正相关(r=0.404,P<0.05).粘连组中HαD-5和HβD-2的表达无相关性(P=0.089).结论 HαD-5、HβD-2在炎症发生时表达明显增强,在正常情况下,两者存在相互促进的协同作用,这种协同作用的破坏可能是粘连形成的原因之一.     

人β防御素-2抗唾液支原体活性研究

目的探讨人β防御素-2（hBD-2）在抗唾液支原体中的作用。方法用唾液支原体感染牙龈上皮细胞HQEC,ET—PCE检测hBD-2的表达情况;将培养的唾液支原体中加入不同浓度的hBD-2,检测其生长情况。结果唾液支原体能诱导HGEC表达hBD2,且hBD-2能明显抑制唾液支原体的生长。结论hBD-2可能在抗唾液支原体感染过程中起关键作用。     

人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达

目的:利用PCR技术对人β-防御素-3基因进行定点突变,将突变后的基因连接入pGEX-4T-1表达载体.方法:采用PCR体外定点突变技术,设计两对引物,引入一个突变点,通过重叠延伸法进行两次PCR扩增,使人β-防御素-3基因第27位密码子由GAG突变为CGA,将突变后的片段克隆入pGEX-4T-1质粒中,转化至E.coli BL21,对鉴定含有目的片段的克隆进行测序.结果:获得预期大小的突变产物,经序列鉴定证实为突变的人β-防御素-3基因. 将诱导后的菌体进行SDS-PAGE电泳,在Mr31 000处可见明显的高表达带.结论:获得突变型人β-防御素-3基因,构建了表达载体,融合蛋白得到表达,为基因工程制备肽类抗生素奠定了基础.     

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：研究具有生物学活性的人防御素2（HBD2）多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法：PCR扩增不合前导序列的HBD2成熟肽的编码框全长的cDNA片段（smHBD2-cDNA），利用BglⅡ和BamHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD2-cDNA的克隆载体，利用NcolⅠ和HindⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET32-nsmHBD2-cDNA，在大肠杆菌中BL21（DE3）中诱导表达含HBD2的融合蛋白，SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD2多肽。采用液体培养法，测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果：构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD2-cDNA表达载体，1、2和4倍smHBD2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52％、48％和31％；而8倍HBD2-cDNA几乎不合可溶蛋白，目标蛋白以包含体形式表达，集中在不可溶部分。重组HBD2对E．coli K12 D31有较强的抑制作用，在终浓度约为0．4至0．5μg／ml时，90％细胞的生长被抑制。结论：采用融合表达、多拷贝串联表达方式，可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用，也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性；适当的多拷贝串联基因可以提高HBD2的产量，但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量，且易形成不溶蛋白；在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD2多肽的原核高效表达。     

卡介苗胞壁蛋白诱导人单核吞噬细胞IL-12和iNOS mRNA表达

目的　研究卡介苗 (BCG)胞壁蛋白的活性组分能否诱导人单核吞噬细胞 IL - 12 P4 0和 i NOS基因表达。方法　应用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法检测 THP- 1细胞 IL - 12 P4 0和 i NOS m RNA在 BCG胞壁蛋白组分刺激下的表达变化。结果　卡介苗胞壁蛋白 Sephadex G- 15 0层析分子量约 2 1～ 2 9k D的组份可诱导 THP- 1细胞 IL -12 P4 0和 i NOSm RNA的表达增强。结论　 BCG胞壁蛋白可刺激人单核吞噬细胞 IL - 12 P4 0和 i NOS基因的增强表达。     

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。     

人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。