登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析

目的扩增登革病毒2型新几内亚株(NGC)E基因,并进行B细胞抗原表位分析。方法根据登革2型病毒NGC株E基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增NGC株E基因并克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α后测序。按Kyte-Doolit-tle方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案预测B细胞抗原表位。结果通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,并对登革2型病毒NGC株E基因进行B细胞抗原表位预测。结论通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。     

登革2型病毒特异性抗原片段的筛选及验证

目的筛选、鉴定登革2型病毒特异性抗原,为进一步研究其生物学功能奠定基础,并利用纯化抗原建立检测登革2型病毒
抗体的ELISA方法。方法分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1-4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E蛋白
进行分析,分析登革2型病毒型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革2型病毒株中的保
守性。然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a原核表达系统进行原核表达,Western blotting验证其免疫学反应特异性,
特异性片段经亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化。结果经系统的生物信息学分析,初步
预测获得登革2型病毒特异性抗原表位8个,并对其中得分值较高的6段进行了高效表达,经Western blotting分析,获得登革2
型病毒特异性抗原片段1段。经纯化后作为检测用抗原,建立了检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。初步应用表明,所建立
方法具备良好的特异性,可检测1~200倍稀释的患者血清,S/N比值均在10以上。结论获得登革2型病毒特异性抗原片段1段,
并建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。
     

HPV18E7抗原B细胞表位的鉴定

目的：鉴定人乳头瘤病毒18型早期蛋白E7的B细胞优势表位的免疫原性。方法：根据亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案预测分析抗原可能的B细胞优势表位肽,并探讨合成肽的免疫效果。结果：HPV18E715-22（LEPQNEIP）,E729-44（EQLSDSEEENDEIDGV）,E751-59（ARRAEPQRH）是可能的B细胞优势表位,其中,E729-44和E751-59可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高。结论：HPV18E729-44具有较强的免疫原性,为E7抗原B细胞优势表位。     

应用因特网对SARS病毒M蛋白B细胞抗原表位的预测

目的：预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位。方法：采用EMBOSS软件结合Hopp＆woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位进行了预测，并用吴玉章等已建立的B细胞表位预测方法进行评述。结果：SARS冠状病毒M蛋白B细胞识别的表位可能位于第3～13和153～166位氮基酸等区域内或附近，这2个被预测的表位均含有β—转角和无规卷曲结构。结论：该研究对应用合成肽抗原进行SARS早期诊断研究及相关抗体的制备具有重要指导意义。     

FSHR胞外区抗原的二级结构预测和B细胞表位预测

目的:分析卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区蛋白的二级结构,在线预测FSHR胞外区潜在的B细胞表位.方法:利用DNAStar Protein软件对FSHR胞外区蛋白的二级结构和表面特性进行分析,联合在线B细胞表位预测,预测FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位.合成预测的B细胞表位肽,对其抗原性进行鉴定.结果:FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位区域为17～34、4244、116～122、142～147、179～193、239～241、266～270、279～282、288～307.选择4个区域合成肽段表位区域能与免疫抗血清发生抗原特异性反应.结论:应用多参数成功预测了FSHR胞外区蛋白抗原的B细胞表位.     

SARS病毒S蛋白的B细胞表位预测

目的预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.方法基于SARS 蛋白基因组序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案,Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对S蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.结果推测最有可能的B细胞表位位于S蛋白N端第91～98区段、第1 121～1 153区段和第185～193区段内或它们的附近.其它,如S蛋白N端第1 050～1 059、752～765、41～50、666～674、264～287、340～348、408～416区段和第424～439区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论用多参数预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位,为分子免疫学的深入研究提供线索.     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的 :对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever ,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特证。方法 :利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果 :B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt(4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 1 0 0 …     

人易感H10N8禽流感病毒血凝素蛋白主要特性及B/T细胞抗原表位预测分析

目的应用生物信息学方法分析人H10N8禽流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)的主要特性,预测可能的B/T细胞抗原表位。方法采用Prot Param预测H10N8禽流感病毒HA蛋白的理化特性,SOPMA预测二级结构,Motif Scan预测翻译后修饰位点,DNAStar分析其序列的亲水性指数、柔韧性指数、可及性参数以及抗原指数,推测B细胞抗原表位的可能位置,并采用SYFPEITHI的T细胞表位预测工具分别预测CTL和Th细胞表位。结果人易感H10N8禽流感病毒HA为亲水性蛋白,二级结构中包含218个α-螺旋、108个β-片层、64个β-转角和171个无规卷曲,具有多个糖基化、酰胺化及磷酸化翻译后修饰位点。经综合各种参数,预测出H10N8禽流感病毒HA蛋白可能存在的7个B细胞抗原表位、7个CTL细胞表位和8个Th细胞表位。结论 HA蛋白B/T细胞抗原表位的预测为人易感H10N8染禽流感病毒的疫苗研制奠定了一定的基础。     

人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位预测

目的 预测人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位.方法 应用互联网软件分析Hopp&Woods亲水性(Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、极性(Polarity)及柔韧性(Flexibility)、Welling抗原性(Antigencity)和二级结构(Secondary structures)等参数,用吴玉章等建立的B细胞表位预测法综合评价.结果 多种预测法重复了人巨细胞病毒UL23开放阅读框编码蛋白的N端第27～43、104～119、125～160位氨基酸区域内或附近,该区域含有B转角和无规卷曲结构,板可能是B细胞识别表位.结论 为应用合成肽或原核表达大片断蛋白制备抗人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的抗体提供了依据.     

SARS病毒S蛋白部分片段B-细胞表位的多参数预测

目的预测SARS病毒S蛋白(spike glycoprotein)部分片段(aa No.400～600 & aa No.1 100～1 195)的B-细胞表位.方法应用多种参数和方法进行综合分析,包括跨膜分析、保守区分析、同源性比较、Hopp ＆ Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角、万氏法等综合预测方法.结果显示B-细胞识别的表位可能在436～456和1 136～1 146残基或其附近,这两个被预测的表位均含有β-转角和不规则卷曲结构.结论本研究为应用合成肽抗原制备抗SARS病毒S蛋白抗体、诊断非典型肺炎(severe acute respiratory syndrome, SARS)提供了依据.     

重组登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表达和免疫学特性研究

目的：构建含登革病毒（DENV）1-4型包膜蛋白（E蛋白）EDIII区的融合蛋白,并通过动物实验分析该融合蛋白的免疫机制。方法：通过生物信息学分析获得具有广泛代表性的DENV 1-4型EDIII区的氨基酸序列;将编码DENV 1-4型EDIII区的基因序列通过GS linker进行串联后插入原核表达载体pColdIII的多克隆位点,并将构建的重组质粒pColdIII-EDIII转化至大肠杆菌BL21（DE3）;通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白表达,采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。将纯化的蛋白免疫BABL/c小鼠,初次免疫之后再加强免疫2次。通过ELISA法检测血清中的抗体效价和细胞因子的分泌情况来评价其免疫效应。结果：重组蛋白EDIII免疫小鼠后可以诱导产生高滴度的特异性抗体,抗体效价为1:40 000。抗原刺激小鼠脾淋巴细胞可以诱导Th1和Th2细胞免疫应答。结论：成功表达了含DENV 1-4型E蛋白EDIII的融合蛋白,并通过动物实验证实该融合蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答,为DENV四价重组疫苗的研制奠定了基础。     

白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化

目的：通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析，了解登革病毒在流行过程中的变异性。方法：用登革2型病毒(DEN-2)NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株，提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸，对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较。结果：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后，子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较，出现3个位点的突变，分别位于第174，215，336位点；亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同。结论：DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变。     

非包被ELISA可检测寨卡病毒包膜蛋白

目的建立一种基于寨卡病毒包膜蛋白（Envelope protein, E）的非包被ELISA方法，检测被感染的细胞内E蛋白的表达情 况，用于抗寨卡病毒药物筛选。方法将寨卡病毒感染的贴壁细胞固定在孔板上，加入抗体与之结合，并确定抗体浓度，建立E 蛋白的非包被ELISA方法；用该方法检测木脂素类化合物C1的抗病毒活性；用实时荧光定量PCR实验（RT-PCR）验证这种非包 被ELISA方法的准确性；并排除该方法对登革病毒的交叉反应。结果经过优化，未感染的细胞的背景OD450降低到0.20左右， 采用该方法检测的抗病毒活性结果，与实时荧光定量PCR实验的结果基本一致，且该方法对登革病毒不存在交叉反应。结论 建立了一种寨卡病毒E蛋白的非包被ELISA方法，可用于抗寨卡病毒药物筛选。     

用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

B族Ⅰ型清道夫受体在丙型肝炎病毒入侵细胞中的作用

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）入侵宿主细胞是由多种受体分子介导的多步骤过程,其中B族I型清道夫受体(SR-BI/SCARB1) 被认为是最先与HCV作用的受体。SR-BI能够与HCV包膜糖蛋白E2相结合,在此过程中位于E2蛋白氨基末端的高变区1（hypervariable region 1,HVR1）起关键作用。SR-BI与HCV的相互作用,不仅能够介导HCV的细胞入侵,还能降低抗体对HCV的中和作用,有助于HCV的免疫逃避。因此,深入研究SR-BI在HCV入侵细胞过程中的作用机制,可望发现在HCV感染的初始环节能够高效地阻断HCV入侵细胞的靶分子,从而预防和治疗HCV的感染。本文就SR-BI的生物学特性、SR-BI与HCV的相互作用对病毒入侵细胞的影响及机制等方面的最新进展作一综述。     

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。     

衣壳蛋白缺失突变登革病毒的制备与鉴定

目的 制备登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的衣壳蛋白缺失突变病毒.方法 在DEN2-43株病毒感染性全长cDNA克隆的基础之上,利用融合PCR技术构建衣壳蛋白基因缺失的全长cDNA,将其线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔法导入宿主细胞获得衣壳蛋白缺失突变病毒.结果 序列比对表明,所获得的恢复病毒带有与预期一致的缺失突变.结论 成功制备衣壳蛋白缺失突变病毒,为进一步研究衣壳蛋白基因突变对登革病毒生物学特性的影响奠定了基础.     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测

目的构建甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的原核表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法以pcDNA3.1(+)/NP为模板,利用PCR方法扩增目的片段NP,再将此片段插入原核表达载体pET-32a(+),并进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的质粒转入表达菌Rosetta-gami(2)中,用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测表达产物。按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplns-Schulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性;用Kyte-Doolittle方法预测其亲水性,Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果成功构建了流感病毒核蛋白(NP)的原核表达载体,经SDS-PAGE检测NP蛋白得到了表达,Western Blot证明表达的重组蛋白具有免疫活性。在蛋白质第6～11、79～91、241～248和319～326区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论流感病毒核蛋白的表达及B细胞表位的预测为流感病毒的快速诊断试剂的研发工作提供了基础。