人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法 根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物，从人胎盘组织中提取总RNA，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插人载体pTARCET^TM质粒中并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒进行鉴定并测序。结果 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920bp的条带．阳性克隆质粒经PCR扩增出约920bp的片段，全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论 通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人pMP12前体蛋白基因，基因序列完全正确。     

人骨形态发生蛋白-7全长基因cDNA的克隆和序列分析

目的:克隆人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)全长基因,并进行测序及序列分析,研究其结构和功能。方法:采用异硫氰酸胍一步法从人胎儿肾中提取总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,分段扩增出hBMP-7全长基因cDNA,与PGEM-T easy连接成PGEM-T easy/hBMP-7重组质粒,采用Sanger双脱氧链终止法测定基因序列。结果:以4号特异引物引导的RT-PCR扩增出BMP-7基因3’端540bp片段,以2号特异引物引导的RT-PCR扩增出BMP-7基因5’端750bp片段,重组连接两片段得到BMP-7全长基因cDNA。与Genebank上发表的hBMP-7序列(XM30619)比较有一个碱基不同,第862位核苷酸由T→G,编码的氨基酸由苯丙氨酸变为缬氨酸。结论:首次从中国人胎肾中分段克隆出BMP-7全基因cDNA,该基因在骨关节系统的损伤与修复中具有重要的临床应用价值。     

可表达骨形态发生蛋白-4的真核表达载体的构建与鉴定

目的构建含有骨形态发生蛋白（hBMP）-4的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hBMP-4。方法将质粒pCS2（＋）／hBMP-4用Eco RⅠ单酶双切获得目的基因片段，真核载体pcDNA3．1（＋）用EcoRⅠ酶切线性化，对上述两种酶切产物分别回收纯化后进行连接，筛选出正确的转化子，并进一步转染COS-7细胞，提取总RNA和总蛋白，进行RT—PCR和Western—blot检测。结果获得了含有目的基因片段的真核表达载体，酶切及基因测序提示构建正确，RT—PCR检测到目的基因的转录，Western—blot检测到hBMP-4蛋白表达。结论利用非定向克隆技术将目的基因转移至真核表达载体中，为进一步研究目的基因打下基础。     

骨形态发生蛋白基因表达的研究进展

近年来,骨形态发生蛋白(bone mophorgenetic protein,BMP)作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视.BMP在骨再生和骨折愈合中起重要作用,新骨的生长是以BMP诱导多能间充质细胞转化为成骨细胞的方式进行的.BMP在调节多种细胞的生长、分化和凋亡过程中起着关键作用[1].本文就BMP和其多体基因表达及调控等问题作一综述.     

骨形态发生蛋白研究进展

随着骨组织工程学的发展,使愈来愈多需要自体或异体骨移植的骨缺损、骨融合可以通过工程化体内骨诱导的形式成骨。其中骨形态发生蛋白是最有应用前景,同时也是近几年国内外研究最多成骨诱导因子,并且已经在临床得到初步的应用。故对其生物特性、传送方式、缓释载体等方面有一个全面的理解是必要的。     

骨形态发生蛋白-7在肾脏病中的研究进展

骨形态发生蛋白-7(BMP-7/OP-1)与肾脏疾病的发生、发展、转归密切相关。它不仅能够维持和促进正常肾组织的发育、形成,而且与肾脏纤维化、急性肾衰竭、糖尿病肾病、狼疮肾炎等关系密切。BMP-7在肾脏高度表达,能够减少血管钙化,改善钙磷代谢,同时具有抗肾脏纤维化作用。     

骨形态发生蛋白在椎间盘退变中的研究

椎间盘退变(IDD)是下腰痛和腰椎间盘突出症的主要原因。在美国,每年大约有570万人被诊断为椎间盘疾病,其中45~64岁年龄段发病率最高。因治疗椎间盘疾病而导致的直接费用和间接损失,譬如劳动力的损失都是巨大的[1]。然而,IDD的细胞生化和病理过程目前尚不够清楚,临床上的保守治疗和手术治疗效果均不甚理想[2]。目前国外对骨形态发生蛋白(BMP)在IDD的病因学及治疗学方面已有许多研究,综述如下。1椎间盘的解剖及退变基础1·1椎间盘的解剖椎间盘是一个高度特异的结构,包括外层的纤维环、内层的髓核和二者之间的移行带。纤维环富含抗张力作…     

骨形态发生蛋白的研究进展

骨形态发生蛋白家族是诱导骨发生的主要活性因子,它具有独特的异位骨诱导活性,与胚胎组织的发育、功能维持及组织的修复均密切相关.本文就骨形态发生蛋白在成骨作用方面的近期研究做一综述.     

Smurf1调节因子在骨形态发生蛋白诱导骨生成中的作用

骨形态发生蛋白(BMP)是明确具有诱导成骨作用的生长因子。其通过结合靶细胞表面受体,活化细胞内一系列Sm ad蛋白,经Sm ad蛋白介导,将信号转导至细胞核内,在一系列辅助因子的作用下,启动成骨基因的表达。细胞内源性Smurf1对这一整个过程起抑制作用。本文就Smurf1调节因子在骨形态发生蛋白诱导骨生成中的作用做一综述。     

BM P-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法 根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用One step RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果 琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示一长约451bp的条带。阳性克隆质粒经双酶切可切出约451bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论 利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121 cDNA/hBMP-4在大鼠骨髓间充质干细胞中的共表达

目的观察重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后的共表达情况,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。方法使用全骨髓培养法分离、培养大鼠MSCs;重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠MSCs,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4成功转染至大鼠MSCs中,并获得有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在大鼠MSCs中获有效表达,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

人白细胞介素15基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人白细胞介素（IL）15全长cDNA,并在大肠杆菌中表达。方法从人外周血分离的淋巴细胞中提取总RNA,通过RT—PCR扩增出hIL-15全长cDNA。构建到原核表达载体pET28a（＋）中,通过卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,扩增后IPTG诱导表达。通过SDS-PAEG及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。结果 成功构建人IL-15表达载体,并表达于大肠杆菌中。SDS—PAEG及Western-blot分析显示表达的融合蛋白分子量为16．1ku,与理论值相符。结论 获得了hIL-15融合蛋白,为hIL-15单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。     

真核双表达载体pIRES-hVEGF121 cDNA/hBMP-4的构建与鉴定

目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定后,转染COS-7细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果真核双表达载体pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4构建成功且hVEGF121cDNA和hBMP-4在COS-7细胞中得到了有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在COS-7细胞中成功表达,为进一步研究打下良好基础。