TLR2介导沙眼衣原体感染早期免疫应答的机制研究

目的 探讨TLR2在小鼠沙眼衣原体生殖道早期感染时的免疫应答中的作用.方法 沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn)经生殖道分别感染野生型小鼠(WT=11只)、TLR2基因缺陷小鼠(TLR2 KO=14只),建立生殖道沙眼衣原体感染模型.分别于感染后不同时间点取阴道棉拭子,获取分泌物,检测分泌物衣原体包涵体数量和炎症细胞因子IL-1α、IL-6和MIP-2水平.结果 TLR2 KO和WT小鼠在每个检测时间点,生殖道分泌物带菌量无差异,且带菌持续时间相同;与WT小鼠比较,在感染后第3d和第10d,TLR2 KO小鼠生殖道分泌物的炎症细胞因子IL-1α、IL-6和MIP-2水平均低于野生型WT小鼠,但差异均无统计学意义(P＞0.05);而在感染后第7d,3种细胞因子均明显低于WT小鼠,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在沙眼衣原体生殖道感染中,TLR2可能介导了早期炎症细胞因子的产生.     

TLR2信号在沙眼衣原体生殖道感染中介导了早期炎症细胞因子的产生

目的探讨TLR2和TLR4在小鼠沙眼衣原体生殖道感染免疫应答中的作用。方法用沙眼衣原体小鼠肺炎株(Mo Pn,1×104IFUs)经生殖道感染野生型小鼠(WT,11只)、TLR2基因缺陷小鼠(TLR2 KO,14只)和TLR4基因缺陷小鼠(TLR4 KO,11只),复制生殖道沙眼衣原体感染模型。于感染后不同时间点取生殖道分泌物,部分用于免疫荧光法检测衣原体包涵体数量,部分用于炎症细胞因子IL-1α、IL-6和MIP-2水平检测。在感染后第70天,处死小鼠,无菌分离腹腔巨噬细胞,于体外衣原体Mo Pn感染,培养24 h后,测定上清液中IL-1α、IL-6和MIP-2含量。细胞因子含量测定均采用ELISA法。结果 TLR2 KO或TLR4 KO小鼠与WT小鼠在每一个检测时间点下生殖道带菌量无差异,且带菌持续时间相同,截止到感染后第38天,3种基因型所有小鼠均清除了下生殖道感染的衣原体。TLR2基因缺失小鼠巨噬细胞产生的炎症细胞因子IL-1α、IL-6和MIP-2水平均明显低于野生型WT小鼠(P0.01),而TLR4基因缺失小鼠巨噬细胞产生的3种炎症细胞因子水平均与野生型WT小鼠无差异(P0.05);TLR2基因缺失小鼠棉拭子标本同样具有较低水平的炎症细胞因子(P0.05)。结论在沙眼衣原体生殖道感染中,TLR2介导了早期炎症细胞因子的产生。沙眼衣原体诱导的早期免疫应答部分依赖于TLR2,而不依赖TLR4。     

TLR4在LPS诱导的结肠炎症恢复中的作用

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)在结肠炎症中的作用,探讨LPS在炎症性肠病中的治疗作用。方法:取正常肠上皮细胞进行体外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预培养。采用慢病毒转染技术,构建TLR4低表达、正常表达及高表达的肠上皮细胞亚组。正常表达组(normal组)及高表达组(high组)培养基中加入LPS诱导细胞炎症,刺激时间分别为0、2、4 h。Western blot法检测TLR4的表达;收集细胞上清液,ELISA检测各亚组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的水平。收集细胞,qPCR检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1βmRNA的表达水平。划痕试验观察对比2组细胞的迁移能力。结果:LPS干预培养细胞后,TLR4的表达量显著增加(P0.05)。ELISA和qPCR检测高表达组与正常表达组组间细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β的蛋白和mRNA水平的差异均有统计学意义(P0.05)。划痕试验提示TLR4高表达组的细胞迁移能力明显高于正常对照组。结论:LPS影响TLR4炎症通路的活化,促进前炎症因子及辅助刺激分子的释放,起到调节炎症反应的作用。     

胶原诱导的关节炎小鼠脾脏单个核细胞TLR8的表达及其与相关细胞因子的关系

目的:观察Toll样受体8(TLR8)在鸡Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型小鼠脾脏单个核细胞中的表达及其与IL-10等细胞因子表达的关系.方法:12只DBA/1J小鼠随机分成造模组和阴性对照组.造模组小鼠采用鸡Ⅱ型胶原诱导,在诱导后的第27天出现关节红肿时处死所有小鼠.用ELISA测定小鼠外周血的TNF-α,HE染色观察小鼠关节的炎症变化,Real-time PCR检测脾脏单个核细胞表达IL-10、IL-17A、IL-1β及TLR8的水平.结果:HE染色结果显示,造模组小鼠关节部位与阴性对照组相比出现明显的炎症细胞浸润;造模组小鼠的外周血血清TNF-α水平较阴性对照组明显升高(P< 0.01);模型小鼠脾脏单个核细胞表达IL-10、IL-17A、TLR8和IL-1β的水平也明显高于阴性对照组(P<0.01或P<0.05).相关性分析表明,TLR8的表达与IL-10的表达呈负相关(r=0.945;P<0.01),而与IL-17A、IL-1β无明显相关性(P>0.05).结论:TLR8在鸡Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型小鼠脾脏单个核细胞中的表达水平明显升高.尽管IL-10的表达水平也高于对照组,但其与TLR8的表达呈现明显负相关.     

Toll样受体2在关节置换术后小鼠表皮葡萄球菌感染中的研究

目的探讨Toll样受体2(TLR2)在关节置换术后感染中的作用。方法构建昆明小鼠的简易右膝关节置换术后表皮葡萄球菌感染模型。将60只动物随机分为假体置换术后感染组(A组)、假体置换术后无感染组(B组)、关节内注射细菌组(C组)和关节内注射生理盐水的对照组(D组)。于操作后的第1、3、7天眼球取血0.2mL,流式细胞术分析TLR2在外周血白细胞的表达;取血后处死并取右膝关节及周围组织作细菌培养。对各组各时相TLR2的表达水平结果进行统计分析,组间同一指标比较采用单因素ANOVA方差分析,同组内同一指标术前术后变化水平比较采用自身配对t检验。结果 A组、C组的组织培养均为阳性,B、D组的组织培养均为阴性。操作后第1天和第3天,A/B组TLR2的阳性表达率比较有统计学意义,P0.05。至第7天,TLR2的表达在各组间的比较差异均无统计学意义。A组和C组对比差异无统计学意义,P0.05。A组第3天的阳性表达率明显低于第1天,P0.05。结论假体植入不影响TLR2的表达,TLR2可能是关节置换术后感染的一项敏感指标。     

地塞米松对小鼠哮喘模型脾巨噬细胞TLR2和TLR4 mRNA表达的影响

目的 检测变应性哮喘模型鼠及地塞米松（dexamethasone,DM）处理的模型鼠脾脏巨噬细胞TLR2和TLR4 mRNA的表达.方法 采用贴壁法分离BALB/c小鼠脾巨噬细胞,以SYBR-greenⅠ作荧光指示剂,次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（hypoxanthine-phosphoribosyl-transferase gene,HPRT）作管家基因,应用LightCycler实时PCR技术,检测TLR2和TLR4 mRNA与管家基因HPRT cDNA的荧光域值循环数（the number of PCR threshold value cycles,Ct）,分别记为Ct2、Ct4和CtH,计算Ct2、Ct4与CtH的比值（Ct2/CtH、Ct4/CtH）为标本的TLR2和TLR4在mRNA水平上的相对表达量.结果 对照组与哮喘组小鼠Ct2/CtH差异有统计学意义（P＜0.05）,哮喘组TLR2 mRNA表达下调;哮喘组与哮喘DM组小鼠Ct2/CtH差异有统计学意义（P＜0.05）,哮喘DM组TLR2 mRNA表达上调;对照组与哮喘组小鼠Ct4/CtH差异无统计学意义（P＞0.05）;哮喘组与哮喘DM组小鼠Ct4/CtH差异有统计学意义（P＜0.05）,哮喘DM组相对哮喘组TLR4 mRNA表达上调.结论 变应性哮喘模型鼠脾脏巨噬细胞TLR4mRNA的表达并没有变化,没有减弱对病原相关分子模式的识别;而变应性哮喘模型鼠脾脏巨噬细胞TLR2 mRNA的表达下调;DM可以上调哮喘组TLR2和TLR4 mRNA的表达;其中的机理有待进一步的深入研究.     

小鼠克雷白杆菌肺炎模型的建立及检测

目的:研究有效建立小鼠克雷白杆菌肺炎模型的方法并进行相关炎症因子检测。方法:构建动物模型,C57小鼠随机分为对照组和模型组,应用气管内注射肺炎克雷白杆菌(106cfu,20#l)的方法建立肺炎模型,感染后24 h,观察小鼠一般状态;收集肺泡灌洗液、分离肺组织,大体观察;肺组织切片HE染色观察两组小鼠炎症情况;肺泡灌洗液进行中性粒细胞计数,肺泡灌洗液和肺组织MPO检测的方法来比较两组小鼠中性粒细胞浸润情况;应用实时定量PCR、Western blot对两组小鼠相关炎症因子进行检测。结果:和对照组相比,模型组小鼠出现明显喘息,寒颤以及竖毛;肺部出现明显的充血、水肿;HE染色显示模型组肺泡壁增厚,大量炎症细胞浸润;模型组肺泡灌洗液中性粒细胞的数量明显高于对照组(P<0.05);模型组支气管肺泡灌洗液和肺组织中MPO表达水平均明显高于对照组(P<0.05);实时定量PCR、Western blot结果均表明模型组小鼠肺组织中炎症因子较对照组明显升高。结论:利用气管内注菌建立小鼠克雷白肺炎模型的方法确实可靠,该模型可用于细胞因子及其受体与克雷白杆菌肺炎关系的研究。     

双歧杆菌对溃疡性结肠炎大鼠肠Toll样受体基因表达的干预作用

目的:探讨双歧杆菌(Bf)活制剂对大鼠溃疡性结肠炎(UC)肠黏膜上皮细胞(IEC)中TLR2、TLR4表达的干预作用,并探讨Bf治疗UC的机理。方法:将40只SPF级SD雄性大鼠随机分为3组:空白对照组、模型组、Bf组。建立大鼠UC模型,Bf组大鼠予双歧杆菌活菌制剂灌服;空白对照组及模型组则正常饲养,不予任何处理。1月后处死全部大鼠,观察大鼠一般情况的变化,分离IECs提取IEC中的总RNA,用RT-PCR法检测TLR2、TLR4的表达。结果:Bf组UC的症状、组织损害均较模型组明显减轻。模型组TLR2、TLR4的表达明显高于Bf组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05),Bf组TLR2、TLR4的表达明显高于空白对照组(P<0.05)。结论:UC大鼠结肠黏膜TLR2、TLR4基因高表达,Bf对TLR2、TLR4基因表达有抑制作用,从而在缓解肠道的炎症中发挥作用。     

低剂量阿奇霉素对铜绿假单胞菌引起小鼠肺部感染的抗炎机制

目的分析阿奇霉素对感染铜绿假单胞菌小鼠的肺组织TLR4表达及相关炎症因子的影响。方法采用气道接种含铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的琼脂糖于Balb/c小鼠,感染后第7天起分别予低剂量阿奇霉素和生理盐水治疗,并于感染后第7、10、14天分别进行支气管肺泡灌洗液中炎性因子IL-6和IL-17的ELISA检测以及肺组织TLR4 mRNA表达水平的定量PCR分析,同时进行肺组织细菌培养、肺泡灌洗液白细胞计数和肺组织病理检查。接种无菌琼脂糖的小鼠做空白对照组。结果阿奇霉素组的小鼠在治疗后肺部感染症状明显改善。感染后第7天,感染PA小鼠肺组织病理损伤程度、细胞因子及TLR4mRNA表达均高于对照组。感染后第10、14天,阿奇霉素组小鼠的IL-6、IL-17及TLR4 mRNA的表达量显著低于同时间点的生理盐水组。第14天时,阿奇霉素组小鼠的IL-17已降至对照组IL-17水平。结论在PA感染初期,低剂量阿奇霉素的治疗可通过下调TLR4表达发挥抗炎作用。     

HDM通过肺泡巨噬细胞TLR4诱导哮喘小鼠气道炎症的机制研究

目的:研究HDM通过肺泡巨噬细胞(AM)Toll样受体4(TLR4)的高表达及诱导AM的活化,探讨其对哮喘小鼠气道炎症的影响.方法:BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组(OVA)A,HDM处理组(HDM+OVA)B,对照组(生理盐水)C.用卵白蛋白(OVA)致敏与激发建立小鼠哮喘模型;HE染色观察小鼠气道及肺组织病理变化;光学显微镜下观察小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞分类及计数;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量,实时定量PCR法测定AM的TLR4的表达,流式细胞技术(FCM)检测AM的CD80、CD86的表达.结果:与A组相比,B组BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的水平显著增高(P<0.05),而IFN-γ差异无统计学意义(P>0.05),与A组相比,AM的TLR4mRNA表达明显增高(P<0.05),CD80的表达差异无统计学意义,CD86的表达水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论:HDM通过AM的TLR4的高表达诱导AM的活化,加重哮喘的气道炎症.     

依托咪酯通过miR-146a 调节TLR4 通路对内毒素急性肺损伤小鼠炎症 反应的保护作用研究

目的:观察依托咪酯对内毒素急性肺损伤小鼠炎症反应的影响,并探讨其作用机制。方法:雄性成年BLAB/c小鼠60只,随机分为空白对照组、模型组、依托咪酯组,每组20只。模型组及药物干预组应用腹腔注射脂多糖(LPS,20 mg/kg)制作急性肺损伤小鼠模型,空白对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。药物干预组于造模后0.5 h给予依托咪酯2.5 mg/kg。空白对照组及模型组给予等体积生理200μl/只。于给药后6 h检测小鼠血清中的内毒素水平,BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量;RT-PCR检测miR-146a、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺组织中的表达;Western blot检测TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺组织中的表达。结果:模型组、依托咪酯组与空白对照组相比,血清内毒素含量、TNF-α、IL-6和IL-1β含量、miR-146a表达水平、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平及TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6蛋白表达均明显升高,差异具有统计学意义(P0.05);依托咪酯组与模型组比较,小鼠血清内毒素含量、TNF-α、IL-6和IL-1β含量、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平及TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6蛋白表达水平均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:依托咪酯能够通过增加miR-146a的含量调节TLR4通路对内毒素急性肺损伤小鼠炎症反应的保护作用。     

Toll样受体3信号通路介导自身免疫性心肌炎炎症反应及作用机制

目的探讨自身免疫性心肌炎大鼠心肌组织Toll样受体3(TLR3)表达水平及临床意义。方法将54只大鼠按照随机数字表法分为AM组、干预组和对照组,每组18只,对照组大鼠正常喂养,AM组、干预组建立自身免疫性心肌炎大鼠模型,干预组于模型建立第21天注射0.1 mg TLR3配体溶液,AM组、对照组大鼠注射等量PBS溶液。分别于模型建立第7、14、21、24、28、35天处死各组3只大鼠,观察各组大鼠心肌组织病理变化,酶联免疫吸附试验检测血清心肌肌凝蛋白自身抗体滴度,免疫组织化学染色法检测心肌组织TLR3蛋白表达,实时定量PCR检测心肌组织TLR3、TNF-αm RNA表达。结果对照组大鼠血清心肌肌凝蛋白自身抗体在不同时间点比较差异无统计学意义(P0.05),干预组血清心肌肌凝蛋白自身抗体滴度在第28天达高峰,AM血清心肌肌凝蛋白自身抗体滴度在第21天达高峰;第14、21、24、28、35天AM组、干预组血清心肌肌凝蛋白自身抗体滴度显著高于对照组(P0.05),第24、28、35天干预组血清心肌肌凝蛋白自身抗体滴度显著高于AM组(P0.05)。对照组TLR3蛋白表达在不同时间点比较差异无统计学意义(P0.05);第14、21、24、28、35天,AM组、干预组TLR3蛋白表达显著高于对照组(P0.05),第24、28、35天,干预组TLR3蛋白表达显著高于AM组(P0.05)。对照组TLR3、TNF-αm RNA相对表达量在不同时间点比较差异无统计学意义(P0.05);第7、14、21、24、28、35天,AM组、干预组TLR3、TNF-αm RNA相对表达量显著高于对照组(P0.05),第24、28、35天,干预组TLR3、TNF-αm RNA相对表达量显著高于AM组(P0.05)。结论自身免疫性心肌炎心肌组织TLR3表达上调,TLR3信号通路介导的炎症反应参与了自身免疫性心肌炎的发病。     

干扰Itk表达抑制CVB3感染小鼠的炎症反应

目的 研究在病毒性心肌炎小鼠模型上敲减Itk蛋白的表达对小鼠炎症反应的影响.方法 BALB/c小鼠尾静脉注射表达Itk-shRNA的质粒后感染CVB3,第4天后观察Itk基因的抑制情况、小鼠存活率,PBMC增殖率及部分炎症性细胞因子的分泌水平.结果 Itk-shRNA转染至小鼠体内后脾细胞中Itk基因的mRNA水平与空白对照组及转染shRNAnon的对照组相比,敲减率约40％(P＜0.05).与转染shRNAnon组相比,Itk-shRNA组中Itk基因表达的抑制导致小鼠PBMC增殖活性降低约41％,小鼠的存活率提高(P＜0.05).Itk-shRNA组血清中细胞因子水平降低.结论 抑制Itk表达能有效降低小鼠PBMC的增殖,同时减少炎症相关细胞因子的分泌,提高小鼠的存活率.     

不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症的影响的研究

目的:研究不同剂量脂多糖(LPS)通过诱导肺泡巨噬细胞(AM)Toll样受体4(TLR4)的高表达, 探讨其对哮喘小鼠肺部炎症的影响.方法:BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组(OVA)A, 低剂量LPS处理组(0.1 mg/L LPS OVA)B, 高剂量LPS处理组(100 mg/L LPS OVA)C, 对照组(生理盐水)D.用卵白蛋白(OVA)致敏与激发建立小鼠哮喘模型;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量, 实时荧光定量PCR法测定AM的TLR4的表达, 光镜观察肺组织病理变化.结果:与A组相比较, B组BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的水平显著增高(P＜0.05), 而IFN-γ差异无统计学意义(P＞0.05), C组BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的水平显著降低, IFN-γ显著增高(P＜0.05);与A组相比, B组与C组AM的TLR4mRNA表达均明显增高(P＜0.05), 两组间差异无统计学意义;光镜下, A组支气管黏膜下水肿, 黏液腺增生, 可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润.B组与C组上述情况未见减轻, 并出现肺泡腔及间质充血, 中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润, D组管腔内无黏液栓, 气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整.结论:低剂量LPS(0.1 mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达, 使肺部炎症加重, 而高剂量LPS(100 mg/L)可能会减轻变态反应症状.     

TLR2及TLR4在侵袭性肺曲霉病小鼠中的表达

目的 研究Toll样受体(TLR)2和TLR4在侵袭性肺曲霉病小鼠中的表达,探讨TLR2和TLR4在侵袭性肺曲霉病中的作用. 方法 将小鼠分为3组:A组为正常对照组;B组为未免疫抑制但感染烟曲霉菌组;c组为侵袭性肺曲霉病(IPA)模型组,给予免疫抑制并感染烟曲霉菌.在感染后8、24、48和72 h时相点,处死小鼠,取肺组织,采用组织病理学方法观察肺组织的病理损伤,RT-PCR法检测肺组织各个时相点的TLR2、TLR4、TNF.ot和β-tublin的表达.TLR2、TLR4、TNF-α的PCR产物电泳条带的扫描密度值与同时扩增的β-tublin电泳条带的扫描密度值的比值用以表示TLR2、TLR4和TNF-α的相对表达水平. 结果 病理观察结果显示,对照组小鼠的肺组织结构正常;正常小鼠感染烟曲霉菌后,小鼠的肺组织有炎症细胞浸润、出血等炎症反应,但未见孢子萌芽生成菌丝;而IPA模型小鼠的肺组织病理损伤严重,可见炎症细胞浸润、肺泡塌陷伴随出血,孢子聚积并萌芽生成菌丝.8、24、48 h 3个时间点的TLR4和24、48 h两个时相点的TNF-α在IPA模型小鼠肺组织中的表达要低于烟曲霉菌感染的正常小鼠(P<0.05),而TLR2在烟曲霉菌感染的正常小鼠和IPA模型小鼠肺组织中呈现低表达,但24、72 h时相点的TLR2在IPA模型小鼠的表达要低于烟曲霉菌感染的正常小鼠(P<0.05). 结论 TLR4及其下游分子TNF-α在IPA模型小鼠肺组织中低表达,在组织病理镜检中可见肺曲霉病典型肺组织病理损伤和孢子生成菌丝.     

mHLA-G 联合PCT、hs-CRP 在肾移植排斥反应及感染中的诊断价值分析

目的:探讨膜型人类白细胞抗原(mHLA-G)联合血清降钙素原(PCT)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)在肾移植排斥反应及感染中的诊断价值。方法:以我院2015年1月～2018年10月126例肾移植患者为研究对象,其中肾功能稳定组42例,术后发生急性排斥反应(AR)组40例,术后发生感染组44例,另选同期健康体检者50例作为正常对照组;对比4组外周血mHLA-G、血清PCT、 hs-CRP水平,分析这些指标在肾移植排斥反应及感染中的诊断价值。结果:肾移植后4周,AR组mHLA-G表达水平最低,与稳定组、感染组、对照组相比差异均有明显统计学意义(P0.05);感染组mHLA-G表达水平最高,明显高于对照组、稳定组、AR组(P0.05);稳定组mHLA-G表达水平略低于对照组,但差异无统计学意义(P0.05)。肾移植后4周,AR组血清PCT水平明显高于稳定组与对照组(P0.05),但稳定组与对照组间无明显差异(P0.05);感染组血清PCT水平明显高于AR组、稳定组、对照组(P0.05)。肾移植后4周,AR组与感染组血清hs-CRP均明显高于稳定组与对照组(P0.05),且AR组与感染组无明显差异(P0.05)。mHLA-G联合PCT、 hs-CRP与在肾移植排斥反应及感染中的诊断价值明显高于单一检测指标。结论:mHLA-G联合PCT、 hs-CRP在肾移植AR及感染中具有重要诊断价值。     

抑制Itk表达对Jurkat细胞分泌细胞因子的影响

目的 研究在Jurkat细胞上敲减Itk蛋白的表达对细胞增殖及炎症相关的细胞因子产生的影响,为Itk作为小分子药物靶标提供可行性实验依据.方法 针对Itk基因设计合成三个shRNAs,通过与pEGFP-C1-hItk质粒共转染,观察其抑制Itk-GFP融合蛋白的表达情况,筛选有效序列包装成慢病毒颗粒.将慢病毒颗粒感染Jurkat细胞,观测Itk蛋白的表达水平、细胞增殖情况及细胞因子的变化.结果 Itk-shRNA1感染Jurkat细胞后Itk基因的mRNA水平与细胞对照组及感染shRNAnon的对照组相比,敲减率约55%,差异有统计学意义P＜0.05.Itk蛋白的敲减导致Jurkat细胞在受刺激时增殖降低,以未感染病毒的Jurkat细胞受刺激后酶标仪检测的A值为1,Itk-shRNA1感染组平均比值为0.54,shRNAnon对照组平均比值为0.83,两组差异有统计学意义,P＜0.05.Itk-shRNA1感染组中IL-2、IL-5、IL-10及IFN-γ等细胞因子水平均较shRNAnon对照组低,差异有统计学意义,提示Itk蛋白的表达减少导致Jurkat细胞产生细胞因子减少.结论 抑制Itk表达能有效降低淋巴细胞的增殖,同时减少与炎症相关细胞因子分泌.     

旋毛虫对三硝基苯磺酸和噁唑酮诱导肠炎小鼠结肠中Th1/Th2类细胞因子表达的影响

目的 研究旋毛虫(T. spiralis)对三硝基苯磺酸(TNBS)和噁唑酮(OXZ)诱导的实验性肠炎小鼠结肠中Th1/Th2类细胞因子表达的影响.方法 雌性BALB/c小鼠,随机分为50%乙醇对照组、T. spiralis应用组、TNBS(OXZ)诱导肠炎模型组、预先感染T. spiralis后诱导TNBS(OXZ)模型组(每组小鼠取材时保证6只以上).对各组小鼠肠黏膜固有层单个核细胞(LPMC)进行分离培养,采用ELISA方法观察感染T.spiralis和未感染T.spiralis小鼠于TNBS或OXZ诱导肠炎后3 d和7 d结肠中Th1/Th2类细胞因子蛋白的表达变化,包括IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10的表达量分析.结果 预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组小鼠在造模后3 d及7 d肠黏膜LPMC产生IFN-γ的水平均低于模型组(P＜0.05),而IL-4、IL-10的表达高于模型组(P＜0.05).预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组小鼠在造模后3 d肠黏膜LPMC产生IL-12的水平低于模型组(P＜0.05),第7天与模型组相比未见明显差异(P＞0.05).预先感染T. spiralis后诱导OXZ模型组小鼠在造模后3 d及7 d肠黏膜LPMC产生IFN-γ、IL-4及IL-10的水平均高于单纯造模组(P＜0.05).结论 T. spiralis对TNBS诱导的肠炎模型小鼠肠道局部免疫作用机制可能是通过诱导Th2型免疫反应及Tr1型细胞因子而抑制结肠炎小鼠Th1型过度免疫应答而实现的.在T.spiralis对OXZ模型小鼠的干预性研究中,没有按理论所设想的感染T.spiralis所产生的Th2型免疫反应会对OXZ诱导的Th2型炎症反应起叠加作用而加重病情.这提示我们,需要进一步探讨T.spiralis对拥有Th2型免疫应答的OXZ模型的具体作用机制.     

TLR2和TLR4单克隆抗体对DSS诱导的小鼠结肠炎肠黏膜细胞因子及肠道菌群的影响

目的 研究Toll样受体2单克隆抗体(Toll-like receptor 2 monoclonal antibody,TLR2McAb)、Toll样受体4单克隆抗体(TLR4McAb)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎组织学改变及肠道菌群结构的影响.方法 雄性BALB/c小鼠分为正常对照组(A)、急性期溃疡性结肠炎模型组(B)、TLR2McAb干预组(C)、TLR4McAb干预组(D)、TLR2McAb+TLR4McAb共同干预组(E),每组10只.A组饮用蒸馏水,B～E组饮用5%DSS水溶液以产生急性期溃疡性结肠炎,造模开始同时,每隔48 h予A、B两组小鼠腹腔内注射生理盐水,C～E组小鼠分别予以10μg的TLR2McAb、TLR4McAb、TLR2McAb+TLR4McAb,期间观察小鼠的疾病活动指数(disease activity index,DAI).干预7 d后处死小鼠,HE染色观察结肠炎症,并进行结肠组织病理学评分(histopathological score,HS);使用real-time PCR法检测各组结肠黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17表达;留取盲肠内粪便对大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌进行培养并比较各菌群菌落计数(colony forming units,CFU)的变化.应用SPSS13.0软件进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 (1)与A组比较,B组的DAI及HS显著增高(DAI:9.700±2.406 vs 0.500±0.707,P<0.01;HS:16.500±2.991 vs 6.400±3.273,P<0.01);C、D组与B组比较DAI及HS差异均无统计学意义(P>0.05);E组的DAI及HS明显低于B组(DAI:5.700±3.498 vs 9.700±2.406,P<0.05;HS:9.500±3.308 vs 16.500±2.991,P<0.01).(2)与A组比较,B组小鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达明显增高;而C～E组结肠黏膜三种细胞因子的表达均有不同程度的降低.(3)A组大肠杆菌数量较少,B～E四组大肠杆菌均明显生长(与A组比较P<0.05),C～E组大肠杆菌数值与B组比较有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05);B组双歧杆菌及乳酸杆菌数量均明显少于A组及C～E组(P<0.05),使用TLR2McAb、TLR4McAb干预后,C～E组双歧杆菌及乳酸杆菌数量上升,与A组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 TLR2McAb、TLR4McAb同时干预对DSS诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎有显著改善作用;两种McAb均能明显提高小鼠肠道内双歧杆菌及乳酸杆菌的菌群数量,从而改善肠道菌群结构,但对大肠杆菌数量无明显影响,且两抗体同时干预对肠道菌群结构的改善未见显著协同作用.     

黄芩、板蓝根等清热解毒药对流感病毒所致肺炎小鼠炎性因子蛋白表达的影响

目的 研究清热解毒代表药物对流感病毒FM1感染肺炎小鼠肺匀浆炎性细胞因子的影响,以筛选出对流感病毒具有更好免疫调控作用的清热解毒中药.方法 建立流感病毒鼠肺适应株(FM1)感染的小鼠肺炎模型,采用双抗夹心ELISA法分别在感染后第1、3、5、7天检测空白对照组、模型对照组、黄芩组、板蓝根组、白头翁组、虎杖组、白花蛇舌草组小鼠肺匀浆TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1、IL-10含量的变化.结果 流感病毒感染小鼠后,模型组TNF-α,IL-1,IL-6,IFN-γ的蛋白表达高于正常空白组,在第3天达峰值,差异有统计学意义(P＜0.05).清热解毒代表药物黄芩、板蓝根均可以降低TNF-α、IL-6、IL-1含量,提高IL-10、IFN-γ的含量,第3、5天时作用较明显,有统计学意义(P＜0.05).白头翁、虎杖及白花蛇舌草对炎性细胞因子在一定程度上有调节作用,但效果不及黄芩和板蓝根.结论 清热解毒代表药物黄芩、板蓝根可通过调节细胞因子水平来干预流感病毒引起的免疫损伤,从而发挥抗流感病毒的作用.