人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达

目的 构建人Toll—like receptor 4（TLR4）胞外段真核表达质粒并观察其表达。方法 通过PCR扩增人TLR4胞外段基因，将其克隆入真核表达质粒pcDNA3．1（＋），重组质粒peDNA3．1（＋）-eTLR4转染入人胚肾293细胞（HEK293 细胞）中，RT-PCR检测TLR4胞外段的表达。结果 测序结果表明，成功构建人TLR4胞外段真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-eTLR4，并在HEK293细胞中获得表达。结论 TLR4胞外段能在HEK293细胞中获得正确表达，为TLR4信号通路的进一步研究打下了基础。     

转染p21基因对宫颈癌Hela细胞转移的影响

目的探讨p21基因转染对宫颈癌细胞系Hela细胞迁移和侵袭的影响。方法 Lipofectamine2000脂质体介导将pc DNA3.1(+)-p21转染宫颈癌Hela细胞,稳定筛选后用RT-PCR检测转染细胞的p21 mRNA的表达。根据转染的不同实验分为空白组、空载体转染组及p21转染组。细胞迁移和侵袭的测定分别采用细胞划痕实验与Transwell小室实验。结果 RT-PCR发现空白组与空载体转染组细胞的p21基因mRNA无表达,p21转染组细胞p21 mRNA高表达;3组细胞0 h划痕宽度差异无统计学意义(P>0.05),48 h后p21转染组的划痕宽度明显变窄,小于空白组及空载体转染组(P均<0.05),空白组及空载体转染组划痕宽度比较无统计学差异(P>0.05)。Transwell小室实验结果表明,48 h后p21转染组的穿透细胞数明显少于空白组及空载体转染组(P均<0.05),空白组及空载体转染组穿透细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 p21能够明显的抑制宫颈癌细胞的迁移与侵袭。     

TLR4在脓毒症大鼠急性肺损伤中作用

目的:研究Toll样受体(Toll like receptors,TLR)4在脓毒症急性肺损伤(acute lung injury,ALI)大鼠肺内的动态表达情况.方法:32只Wistar大鼠随机分成对照组12只与ALI组20只.实验6,12,18,24 h后分别处死大鼠.采用Real-time PCR测定肺组织TLR4 mRNA表达,免疫组织化学观察肺组织TLR4蛋白的表达情况.结果:ALI组与对照组比较,肺组织TLR4蛋白和TLR4 mRNA表达增加(P<0.01).ALI组TLR4蛋白和TLR4 mRNA在盲肠结扎穿孔术术后逐渐增加至18 h达高峰,后逐渐下降.结论:TLR4升高与脓毒症ALI的发生、发展密切相关.     

TLR4基因多态性与儿童ARDS易感性的相关性研究

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)-Thr399Ile、Asp299Gly基因多态性与儿童急性呼吸窘迫综合征(ARDS)易感性的关系。方法:收集江西省儿童医院PICU和NICU儿童急性呼吸窘迫综合征(ARDS)诊断病例为病例组,类似年龄的健康儿童为对照组,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术及基因测序技术检测TLR4等位基因Asp299Gly和Thr399Ile基因型的多态性,观察两组间基因型频率和等位基因频率的差异。结果:2007~2012年儿童ARDS组48例,对照组59例,TLR4受体基因Asp299Gly、Thr399Ile两位点的基因型之间差异无统计学意义(χ2=0.010,P=0.920;χ2=0.412,P=0.52)。结论:儿童ARDS患者的TLR4基因Asp299Gly和Thr399Ile多态性与感染性ARDS发病无显著相关性。     

TLR4在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织中的表达

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织中的表达。方法将60只小鼠随机分为两组:对照组(气管内注入生理盐水)和纤维化组(气管内注入博来霉素5 mg/kg)。处理后用实时定量PCR和免疫蛋白印迹法分别在7、14、21 d观察肺组织中TLR4m RNA和蛋白质的表达。此外,通过HE染色判断肺纤维化的程度。所有数据均用均数±标准差(sx±)表示,两组之间比较采用t检验,多组之间比较采用方差分析。结果 14、21 d纤维化组TLR4 m RNA表达明显高于对照组(P<0.05),且在第21天达到高峰。与对照组相比,纤维化组TLR4蛋白表达增加,21 d达高峰。结论在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中,TLR4的表达与炎症和肺纤维化均密切相关。     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1080bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

TLR4基因多态性与社区获得性肺炎易感性及预后的研究进展

一、基因多态性 基因多态性是指在一个生物群体中同时存在的2种或多种不连续的基因型或等位基因,是基因的固有特征.人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性,疾病临床表现的多样性(clinical phenotype diversity),以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用.基因多态性现象影响着遗传性疾病的发病率,如:DQB1位点的基因多态性与精神分裂症有关联[1];过氧化物酶增殖物激活受体(PPARs)基因家族中,PPAR-γ基因Pro12Ala突变与2型糖尿病遗传易感性相关[2].     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景:目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。目的:构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。方法:从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1080bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。结果与结论:含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

连续性肾脏替代治疗对重症肺炎所致急性肾损伤患者TLR2和TLR4的影响

目的探讨连续性肾脏替代(CRRT)治疗对重症肺炎(SP)所致急性肾损伤(AKI)患者Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)的影响。方法采用前瞻性研究方法,选取2018年1月至2019年11月新疆维吾尔自治区人民医院收治的98例SP所致AKI患者,采用随机数字表法将其分为两组:对照组和观察组,每组各49例。对照组患者采用间歇性血液透析治疗,观察组患者采用CRRT治疗。比较两组患者的急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(A-PACHEⅡ)、序贯性脏器衰竭评分(SOFA)、肾功能指标[血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血乳酸(Lac)、血尿酸(UA)、尿量(UO)]、T细胞亚群(CD4~+、CD4~+/CD8~+)变化、炎症指标[C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL-6)、TLR2、TLR4)]水平,并采用Kaplan-Meier生存曲线(K-M)分析两组患者1个月的生存情况。结果治疗后,观察组患者的APACHEⅡ(6.72±1.59分)、SOFA评分(2.02±0.58分)均低于对照组(10.11±2.48分,3.67±0.67分),差异具有统计学意义(P0.05);治疗后,观察组患者的SCr(184.47±50.01μmol/L)、BUN(12.39±1.58 mmol/L)、Lac(2.15±0.66 mmol/L)、UA(184.29±68.52μmol/L)均低于对照组(256.29±86.73μmol/L,15.34±1.27 mmol/L,2.73±0.81 mmol/L,247.15±70.69μmol/L),UO[0.57±0.12 ml/(kg·h)]高于对照组[0.48±0.11 ml/(kg·h)],差异均具有统计学意义(P0.05);治疗后,观察组患者的CD4~+(35.83±3.77%)、CD4~+/CD8~+(1.20±0.11)高于对照组(32.49±3.51%,1.01±0.10),差异均具有统计学意义(P0.05);观察组治疗后CRP(80.82±16.47 mg/L)、IL-6(96.44±20.39 ng/L)、TLR2(2.58±1.09 ng/ml)、TLR4(1.89±0.26 ng/ml)低于对照组(107.52±25.19 mg/L,118.45±35.07 ng/L,4.29±1.12 ng/ml,2.24±0.35 ng/ml)(P0.05);两组K-M曲线比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 CRRT治疗SP所致AKI,可减轻肾脏负担,促进肾功能恢复,增强机体免疫功能,降低炎症因子表达,减少炎症因子对肾脏的损害,改善患者病情。     

miRNA-21siRNA对宫颈癌Hela细胞周期及细胞凋亡的影响

目的探讨microRNA-21(miR-21)siRNA对宫颈癌Hela细胞周期和细胞凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR检测Hela细胞转染后siRNA干扰组及阴性对照组中miR-21的表达量。流式细胞仪分析Hela细胞周期及凋亡率的变化。结果转染siRNA干扰载体后,实时荧光定量PCR检测Hela细胞中miR-21明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05),空白对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);siRNA表达载体可明显增加细胞凋亡率,并显现出G_0/G_1期阻滞作用。结论miR-21siRNA干扰载体可以高效地抑制宫颈癌Hela细胞miR-21基因的表达,增强细胞的凋亡,并使细胞周期阻滞于G_0/G_1期。     

TRPV4对HeLa细胞增殖的作用

目的 观察瞬时感受器电位离子通道香草素受体4（TRPV4）与宫颈癌HeLa细胞增殖的关系.方法 采用宫颈癌HeLa细胞系,用Western blot技术检测HeLa细胞中TRPV4的表达量;并分别用TRPV4阻滞剂RN1734干预体外培养HeLa细胞,通过细胞计数法、LDH检测及流式细胞技术观察TRPV4通道调控对HeLa增殖和细胞周期进展的影响.结果 与对照组W12细胞系相比,宫颈癌HeLa细胞系中TRPV4呈高表达.TRPV4阻滞剂干预48和72 h后,HeLa细胞增殖较未干预组降低（P＜0.05）;而TRPV4阻滞剂干预24h和48 h时,处于S期细胞的百分率明显低于未干预组;处于G0/G1期细胞的百分率则明显高于未干预组（P＜0.05）.结论 TRPV4抑制可以阻滞体外培养宫颈癌HeLa细胞增殖及细胞周期进展.     

EphA4基因在K562细胞野生株与耐药株中的表达差异

目的 观察EphA4基因在K562细胞野生株与耐药株中的表达情况,为研究EphA4在白血病发生发展中的作用奠定基础.方法 以荧光实时定量PCR方法检测K562细胞野生株与耐药株中EphA4基因表达.结果 E-phA4基因在K562细胞野生株中的表达明显高于K562细胞耐药株,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 根据EphA4在K562细胞野生株与K562细胞耐药株中的表达差异显著,推论EphA4这种差异的存在对于研究K562细胞所代表的慢性粒髓系白血病的作用机制、病理演变、临床表现及预后具有一定意义.     

阿司匹林对宫颈癌Hela细胞COX-2mRNA表达的抑制作用

目的研究COX-2非选择性抑制剂阿司匹林（Aspirin）对宫颈癌细胞株Hela的细胞增殖的抑制作用及COX-2mRNA表达量的影响。方法Hela细胞分4组培养在6孔板上设对照组及实验组，观察不同剂量阿司匹林作用后细胞的增殖状态及采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PcR）检测阿司匹林作用前后Hela细胞COX-2mRNA量的变化。结果阿司匹林能抑制Hela细胞增殖及细胞中COX-2mRNA的转录，且抑制强度随阿司匹林的浓度的提高而增加。结论体外阿司匹林抑制癌细胞Hela生长，并从mRNA水平抑制COX-2蛋白的表达，对宫颈癌可能有潜在治疗意义。     

体外合成特异siRNA及其对Hela细胞端粒酶基因表达抑制的研究

目的 针对端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因不同片断合成2条siRNA,比较其对Hela细胞端粒酶基因表达干扰作用的强弱,从而选择出更好的干扰靶位点.方法 用T7RNA聚合酶在体外转录合成siRNA,将合成的2段siRNA转染Hela细胞,对其干扰作用进行分析、鉴定.结果 用2段合成的特异siRNA转染Hela细胞...     

氧化低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞TLR4和Emilinl表达的影响

目的 观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)TLR4和Emilinl表达的影响及转化生长因子-β(TGF-β)在其中所起的作用.方法 将传至2～4代的大鼠VSMCs,用不同浓度的OX-LDL(20、50、80、100μg/ml)干预,采用RT-PCR检测TLR4和Emilinl mRNA表达变化.另设100μg/ml ox-LDL+TGF-B(0.01、0.1、1、10μg/1)培养24h,采用RT-PCR检测TLR4 mRNA表达.结果 (1)用四种不同浓度梯度的ox-LDL作用后的VSMCs,TLR4和Emilinl在mRNA水平均比空白对照组表达增加,并且呈浓度依赖性.(2)不同浓度TGF-B(0.01、0.1、1、10μg/1)作用后的ox-LDL组(100μg/ml)TLR4 mRNA表达明显下降,且呈浓度依赖性.结论 ox-LDL可诱导大鼠VSMCs TLR4和Emilinl的表达,促进炎症的发展,ox-LDL可通过使VSMCs Emilinl表达增高途径抑制TGF-β的表达,最终达到促进TLR4高表达的目的 .ox-LDL对TGF-β的抑制作用是上调VSMCs TLR4表达的重要途径之一.     

Role of TLR4 for paclitaxel chemotherapy in human epithelial ovarian cancer cells

Background  Paclitaxel has been reported to be a ligand to Toll like receptor 4 (TLR4). Myeloid differentiation factor 88(MyD88) was described as a myeloid differentiation primary response gene. TLR4 signalling owns two pathways: MyD88-dependent and MyD88-independent pathways. XIAP is a key member of the inhibitor of apoptosis protein family. Akt is a major downstream target of growth factor receptor tyrosine kinases, which negatively regulates apoptotic pathways through phosphorylation (pAkt). The aim of the present study is to investigate the role of TLR4 in paclitaxel resistance of ovarian cancer cells.
Materials and methods  We reconstructed the RNA interference expression vector, pGenesil-1-U6 specifically targeting TLR4 mRNA, which was stable transfected into the human ovarian cancer cell line SKOV3 (MyD88-positive expression) and A2780 (MyD88-negative expression). Cell proliferation, cell cycle distribution and cell apoptosis were assessed in the cells transfected with scramble control shRNA (SKOV3/shControl, A2780/shControl) and TLR4 shRNA (SKOV3/shTLR4, A2780/shTLR4) to explore the possible functions of TLR4 in ovarian cancer cells growth. The expression of TLR4, MyD88, XIAP, Akt and pAkt was analysed by Western blot analysis.
Results  A knockdown of TLR4 levels down-regulated the expression of XIAP and pAkt. And it restored the inhibitory effect of paclitaxel on cell proliferation and impeding cell cycle progression in SKOV3 cells.
Conclusions  It suggests that TLR4 negatively regulates paclitaxel chemotherapy and MyD88 is an essential downstream factor to TLR4 signalling for this resistance. Knockdown of TLR4 induces paclitaxel chemosensitivity which might depress the Akt pathway. The TLR4-MyD88 signalling represents an important source to promote tumour growth.     

萘普生对体外宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨萘普生对人子宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响。方法:用含不同浓度的萘普生细胞培养液(1、10、100、300、500μg/mL)于不同作用时间(6、12、24、48h)处理宫颈癌Hela细胞48h后,采用MTT法检测不同浓度的萘普生细胞培养液在不同作用时间下对Hela细胞增殖率的影响;用500μg/mL的萘普生细胞培养液处理宫颈癌Hela细胞48h后荧光显微镜观察细胞形态变化,并采用Annexin V-FITC/PI染色,以流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:(1)MTT法显示,不同浓度的萘普生细胞培养液对Hela细胞均有抑制作用,不同药物浓度组在同一作用时间下对Hela细胞生长抑制率的差异有统计学意义(P<0.01),同一药物浓度在不同作用时间组之间的细胞生长抑制率的差异也有统计学意义(P<0.01)。(2)Hoechst33342染色后,经荧光显微镜观察,可见到染色质浓缩及凋亡小体等凋亡特征。(3)流式细胞仪检测显示萘普生处理宫颈癌Hela细胞48h后,细胞凋亡率明显增加。结论:萘普生在体外对Hela细胞增殖具有抑制作用,且抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性。     

TLR2、TLR4、TLR5和TLR9在小鼠Hp感染模型中的表达

目的:研究BALB/c小鼠在幽门螺杆菌(Hp)感染前后和用抗生素治疗后胃黏膜组织中Toll样受体(TLR)2、TLR4、TLR5、TLR9、IL-1β的表达,探讨Toll样受体家族在Hp感染机制中的作用。方法:60只BALB/c小鼠随机分为3组,第1组不予处理(正常组),第2组予感染Hp(Hp感染组),第3组感染Hp后予抗生素治疗(抗生素治疗组)。RT-PCR和Western blotting法半定量检测小鼠胃内TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、IL-1β的表达,Giemsa染色切片计数Hp定植数量,HE染色切片判断黏膜炎症水平。结果:(1)TLR5、TLR9在各组小鼠胃黏膜组织中均无表达。(2)TLR2在Hp感染组胃黏膜组织中表达(PCR:0.13±0.025;Western:1.32±0.27)高于抗生素治疗组(PCR:0.04±0.011;Western:0.43±0.08),正常组无表达。(3)TLR4在Hp感染组胃黏膜组织中表达(PCR:0.22±0.051;Western:0.72±0.17)高于抗生素治疗组(PCR:0.06±0.009;Western:0.21±0.04),正常组无表达。(4)IL-1β在Hp感染组胃黏膜组织中有表达(PCR:0.27±0.038;Western:0.58±0.14),抗生素治疗组和正常组无表达。结论:TLR2、TLR4可能参与了Hp的致病机制,TLR5、TLR9可能未参与Hp的致病机制。     

Pam 3CysS K4对糖尿病小鼠肾功能及肾小管上皮细胞 TLR2表达的影响

【目的】探讨 Toll 样受体（Toll‐like receptors ,TLR）的特异激动剂 Pam3CysSK4对糖尿病小鼠肾功能及肾小管上皮细胞 Toll 样受体2（TLR2）表达的影响。【方法】选取 C57小鼠24只,随机分为正常组、糖尿病模型组（模型组）和干预组,每组8只,模型组采用链脲佐菌素（STZ）诱导建立小鼠糖尿病模型,干预组建立糖尿病小鼠模型后并给予股静脉注射 Pam3CysSK4,每周给予100μg ,正常组小鼠给予与其他两组等量枸橼酸缓冲液注射。三组喂养8周后,收集24 h 尿液,检测24 h 尿蛋白;称小鼠体重、肾重,计算肾重／体重;检测血清肌酐（Cr）,血尿素氮（BUN）、血糖及白细胞介素‐1（IL‐1）评估肾小球硬化指数,检测肾小管上皮细胞 TLR2、核转录因子‐κB （NF‐κB）及髓样分化因子88（MyD88）、单核细胞趋化蛋白‐1（MCP‐1）表达水平。【结果】干预组和模型组血糖均高于正常组;干预组小鼠体重和24 h 尿量低于模型组,而模型组低于正常组;干预组小鼠肾重和肾重／体重高于模型组,而模型组高于正常组,其差异均有统计学意义（ P ＜0．05）。干预组和模型组 Cr 、BUN 、IL‐1 和24尿蛋白含量、肾小球硬化指数及 TLR2、NF‐κB 、MyD88和 MCP‐1均高于正常组,而干预组高于模型组,其差异均有统计学意义（ P ＜0．05）。【结论】高糖能够上调小鼠肾小管上皮细胞 TLR2水平,激活 TLR 信号转导通路,促进炎症因子的释放,增加对肾脏的损伤作用。