阳离子脂质体介导的hIL-12基因在COS-7细胞中的表达

目的 观察hIL-12基因在COS-7细胞中的表达。方法 阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将质粒pCA13-hIL-12转入COS-7细胞,PCR法检测基因转染,ELISA法检测hIL-12的表达。结果 hIL-12基因成功导入COS-7细胞,并且在COS-7细胞中获得表达。结论hIL-12可以在COS-7细胞中获得表达。     

雌激素对C6神经胶质瘤细胞的作用

目的　从细胞与分子水平观察雌激素受体 (ER)α,β2种亚型在C6神经胶质瘤细胞的表达 ,初步研究雌激素对大鼠C6星形神经胶质瘤细胞的细胞活性、增殖活动和细胞[Ca2 + ]i 水平的影响 .方法　应用细胞培养、免疫细胞化学、RT PCR技术、MTT法、3 H TdR掺入法和激光扫描共聚焦技术 .结果　①C6细胞中检测到ERβ免疫反应阳性物质 ,未发现ERα免疫反应阳性物质 ;②ERβmRNA在C6细胞中有表达 ,未检测到ERαmRNA ;③ 17β estradiol (10 -7～ 10 -5mol·L-1)可显著提高C6细胞活力 ,但对细胞增殖程度无明显的影响 ;④ 17β estradiol (10 -6mol·L-1)作用后数 10s后C6细胞 [Ca2 + ]i荧光强度显著增强 .结论　C6细胞表达ERβ的mRNA与蛋白 ,在神经胶质瘤细胞中ERβ可能是介导雌激素信号传递的关键环节 ;雌激素可发挥细胞保护作用 ;雌激素使细胞 [Ca2 + ]i增加 .     

苯乙酸对胶质瘤细胞C6DNA合成的抑制作用

目的：观察诱导分化剂苯酸对胶质瘤细胞Ｃ６的诱导分化作用，并在发子水平上探讨其作用机理。方法：细胞计数和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞周期。结果：苯乙酸对细胞增殖存在剂量（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）依赖性抑制，免疫细胞检测ＣＰＭ值降低，肿瘤细胞ＤＮＡ合成减少，细胞周期分析Ｇ０／Ｇ１期所占比例下降，Ｓ期相对升高。结论：苯乙酸可阻抑细胞增殖周期，使细胞周期增殖循环上止     

131I近距离放射对C6胶质瘤细胞杀伤的实验研究

目的 探讨131I近距离放射杀伤培养C6胶质瘤细胞的有效剂量率及有效剂量,指导治疗计划.方法 将负载活度60mCi 131I的放疗囊置于距离培养的C6胶质瘤细胞5mm、30mm处照射,持续72h/次,每隔4d用Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术以及克隆形成率法检测照射后C6胶质瘤细胞的凋亡率和细胞存活分数.结果 照射72h后能诱导部分瘤细胞凋亡,凋亡率可达16.42％±1.66％;瘤细胞存在增殖性死亡现象;瘤细胞存活分数在72h照射后下降,最低为59.0％±2.39％;在131I近距离放射时,较低剂量率(＜400mGy/h)情况下,也可诱发C6胶质瘤细胞凋亡.在剂量率186.6-677.8mGy/h区间,随剂量率加大凋亡率反而减小.诱导瘤细胞凋亡的有效吸收剂量率应≥47.64-61.65mGy/h,72h累计吸收剂量≥3.9Gy.结论 放疗囊负载131I近距离照射72h后可诱发C6胶质瘤细胞部分凋亡,瘤细胞存活分数下降.诱导C6胶质瘤细胞凋亡的有效剂量率应≥47.64-61.65mGy/h,72h有效累计吸收剂量≥3.9Gy.     

Nkx2．2的克隆及其在C6细胞中的表达

目的：克隆大鼠转录因子Nkx2．2,构建其真核表达载体,并观察其在大鼠C6胶质瘤细胞系中的表达．方法：利用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增包含Nkx2．2编码区的cDNA片段,克隆连接至pMD20-T载体,再以pMD20-T—Nkx2．2为模板扩增出Nkx2．2编码区序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3．1-myc-his（-）中,测序验证后,转染C6胶质瘤细胞．用anti—His抗体和间接免疫荧光染色法检测Nkx2．2在C6细胞中的表达．结果：测序证实所克隆的Nkx2．2编码区正确地连接入pcDNA3．1-myc—his（-）中,免疫荧光检测证实其在C6细胞中得到了有效表达．结论：成功克隆了大鼠Nkx2．2编码区片段,构建了其真核表达载体,并在C6细胞中得到了有效表达,为进一步研究Nkx2．2基因的功能,尤其是探讨其在神经系统中的作用奠定了基础．     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

基因转移载体脂质体和重组腺病毒介导碱性磷酸酶基因在B16F1细胞中的表达比较

目的：探讨两种基因转移载体脂质体转染的和重组腺病毒收集并转导的SEAP基因在B16F1细胞中的表达动态。方法：脂质体和质粒DNA复合后，转染10^6 B16F1细胞，连续5d收集并换细胞培养液，并检测其中的SEAP酶活性，将重组腺病毒以1000m.o.i,2000m.o,i,3000m.o.i,4000m.o.i接种B16F1细胞，连续5d收集并换细胞培养液，并检测其中SEAP的含量，结果：随着时间的推移，脂质体转染的SEAP的表达逐渐下降，由第1天的821．6μUmit/ml下降到第5天的275．2μUnit/ml，腺病毒转导的SEAP的表达却是逐渐上升，并随接种毒量的增加而上升，且第三，四天表达达最高后，能保持较稳定的水平，接种4000m.o.i组，SEAP的表达由第1天的93．9μUnit/ml上升到第3天1281.1μUnit/ml，到第5天仍为1240．4μUnit/ml，结论：脂质体和重组腺病毒作为不同的基因转移载体都能有效地介导外源基因的转移入靶细胞，并使外源基因在靶细胞内获得有效地表达，但表达的动态过程完全不同。     

PDGF-B链基因TFO抑制C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因表达及细胞生长

目的：观察PDGF—B链基因三链形成寡核苷酸(triplex—forming oligonucleotide，TFO)对C6胶质瘤细胞PDGF—B链基因表达和细胞生长的作用。探索PDGF-B链基因TFO作为抗肿瘤治疗新药的可能性。方法：应用MTT法观察PDGF—B链基因TFO对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用；应用流式细胞技术观察PDGF-B链基因TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因表达的影响。结果：PDGF—B链基因TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因的表达和细胞生长有明显抑制作用，而且抑制作用存在浓度依赖性。结论：PDGF-B链基因TFO能够抑制C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因的表达和细胞生长，有望成为抑制PDGF—B原癌基因表达的一种全新药物。     

Ttll1对C6胶质瘤细胞作用的研究

目的:探讨微管酪氨酸连接酶1(tubulin tyrosine ligase-like 1,Ttll1)对C6胶质瘤细胞生长的影响。方法:构建pEGFPN1-Ttll1真核表达载体,将pEGFPN1-Ttll1表达载体和pEGFPN1荧光空载体分别转染C6细胞系,荧光显微镜观察拍照,采用Scion Image软件测量每个视野中转染细胞总数和每个转染细胞的突起总长度及细胞体的面积;流式细胞术分析细胞周期;MTT试验检测细胞活力。结果:转染pEGFPN1-Ttll1的C6细胞的胞体面积比转染pEGFPN1的C6细胞的胞体面积小,且前者的突起长度比后者短,两者都有极显著性差异;转染pEGFPN1-Ttll1后未影响C6细胞的细胞周期,也未发现细胞凋亡;转染pEGFPN1-Ttll1后与转染pEGFPN1相比,细胞活力差异无统计学意义。结论:Ttll1可能对C6胶质瘤细胞胞体和突起的生长起负性调控作用,但并没有影响细胞周期和细胞的活力。     

人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达

目的：观察人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达及其对转染的Hep-2细胞的作用。方法：用RT-PCR方法获取人caspase-6全长cDNA，经重组PCR构建大小亚基次序颠倒的重构型caspase-6(re-caspase-6，简称rcasp6)。将所获重组基因克隆入真核表达载体pCMV，转染Hep-2细胞。用间接免疫荧光法及免疫细胞化学染色检测目的蛋白表达，HE染色和电镜观察转染细胞的形态和结构的变化，细胞计数检测转染目的基因后细胞生长状况的变化。结果：成功地获得了人重构型caspase-6基因(rcasp6)，并构建了真核表达载体，转染Hep-2细胞后，检测到目的蛋白的表达，倒置显微镜观察转染细胞有明显变化，培养情况下出现大量细胞固缩变小，伴随有细胞死亡。HE染色和电镜观察显示，固缩的细胞呈现凋亡的典型特征。结论：人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现大量的凋亡细胞。     

sTRAIL真核表达载体的构建及其对裸鼠胶质瘤的治疗作用

目的构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对裸鼠种植性胶质瘤生长的抑制作用。方法通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL。以阳离子脂质体介导转染裸鼠种植性胶质瘤细胞，同时设立未转染、空质粒转染及Lipofectin转染组，检测转染阳性率，并观察该基因载体对种植瘤生长的抑制作用。结果经过测序鉴定和蛋白表达检测证实，重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质体介导质粒转染种植瘤瘤细胞阳性率达50％。脂质体PcDNA-sTRAIL转染种植瘤细胞后，相比未转染、空质粒转染及Lipofectin转染组，种植瘤体积、重量增长明显受抑制（均P〈0.05），表现出一定的肿瘤细胞增殖抑制作用。结论本研究成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体，并从体外实验中初步证实了其对裸鼠种植性胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。     

阳离子脂质体介导的Ａ20基因转染人外周血单核细胞的可行性

目的探讨阳离子脂质体介导的A20基因转染人外周血单核细胞的可行性及最佳转染条件。方法采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pCAGGS-GFP／A20质粒转染人外周血单核细胞,通过荧光显微镜检测GFP报告基因,RT-PCR检测A20基因表达。结果应用LipofectamineTM2000介导的A20基因转染人外周血单核细胞,在2×10 6／L细胞接种浓度,脂质体与质粒的量之比为4μl：3μg时,转染效果最佳,RT-PCR证实成功获得A20目的基因的表达。结论脂质体转染法可介导A20基因在人外周血单核细胞获得表达,该研究为A20基因转染的相关实验研究提供参考依据。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

酸性成纤维细胞生长因子在培养的乳鼠心肌细胞中分泌表达及其意义

目的:研究非促分裂型haFGF(non-mitogenic human acidic fibroblast growth factor,nm-haFGF)真核表达载体(pSecTag/nm-haFGF)在原代培养的新生SD乳鼠心肌细胞中的分泌表达及其对心肌细胞生理特性的影响.方法:采用脂质体转染的方法将真核表达载体pSecTag/nm-haFGF转染原代培养的心肌细胞,转染48h后用免疫印迹法(western blotting)检测nm-haFGF的表达状况,同时用H2O2造成心肌细胞损伤,观察nn-haFGF对心肌细胞的保护作用,并观察心肌细胞生理特性的变化.结果:转染后48h,心肌细胞在转染nm-haFGF基因后能够表达目标蛋白,而空载体实验组和未转染组均为阴性;MTF法检测结果表明,nn-haFGF基因的表达产物具有生物活性,对H2O2造成的心肌细胞损伤有一定的保护作用;pSecTag/nm-haFGF组的细胞搏动率明显高于阴性对照组,nn-haFGF基因的表达产物对维持心肌细胞的生理特性具有积极的作用.结论:转染nh-haFGF cDNA能够在原代培养的SD乳鼠心肌细胞中分泌表达,并具有其相应的生理活性,对H2O2损伤的心肌细胞具有保护作用.     

小鼠endostatin基因的克隆与C6鼠脑胶质瘤的治疗

目的 克隆小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,检测其表达蛋白的生物学活性,应用该蛋白治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法 从小鼠胶原ＸⅧｃＤＮＡ用ＰＣＲ法克 ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,重组入ＰＵＣ１９,测序后构建非融合表达载体ｐＤＨ－ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ,使其在ＤＨ５α内经温度诱导表达,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒 囊膜 内皮细胞抑制实验检测其活性,经荷瘤大鼠皮下注射该蛋白治疗其脑胶质瘤,结果 成功获得５５１ｂｐ的ｅ     

NGX6基因在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨NGX6基因在肝细胞癌及癌旁组织中有无表达及其与临床病理特征的关系.方法:肝细胞癌患者组织标本分为癌与癌旁对照组,应用RT-PCR检测45例肝细胞癌及配对癌旁组织NGX6表达,并对其表达和各临床病理参数的关系进行分析.结果:癌组织NGX6阳性表达率35.5%(16/45),NGX6表达强度相对值为0.245±0.060;癌旁组织阳性表达率为77.8%(35/45),强度相对值为0.352±0.113;癌与癌旁组织的表达阳性率及强度比较差异有统计学意义(P<0.05);肝细胞癌组织NGX6表达与TNM分期(x2=6.106,P=0.042)、淋巴结转移(x2:5.237,P=0.022)有关.结论:NGX6基因转录水平的表达降低或缺失,可能在原发性肝细胞癌的发生过程中起了重要作用,NGX6基因表达水平有可能作为一项早期预测肝癌发生发展的指标.