Effects of nerve growth factor on nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary cortical cultures

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）ｏｎｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｒｅｌｅａｓｅａｎｄｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｃＮＯＳ）ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ...     

神经生长因子对化学性缺氧神经细胞的保护作用

目的：研究NGF对化学性缺氧神经细胞的保护作用。方法：采用原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经细胞KCN急性缺氧损伤模型，观察系列实验指标：利用MTT比色法观察NGF(100ng／ml)对缺氧神经细胞的作用；检测细胞外液LDH释放量以观察NGF对缺氧神经细胞膜稳定性的影响；光镜、透射电镜观察NGF对缺氧神经细胞形态的影响。结果：NGF能改善细胞形态，提高缺氧神经细胞的活力，降低LDH释放量。结论：NGF对化学性缺氧神经细胞有保护作用。     

灯盏花素对氯化钾诱导的培养平滑肌细胞内游离钙的影响

目的:观察灯盏花素对氯化钾诱导的培养的家兔平滑肌细胞内游离钙的影响.方法:用RF_5000荧光光度仪检测Fura-2AM负载的培养平滑肌细胞内游离钙的浓度.结果:在有细胞外钙存在时,静息条件下细胞内游离钙为330±100nmol·L-1,灯盏花素能轻度降低静息状态下细胞内游离钙,但无统计学意义.氯化钾50mmol·L-1将细胞内游离钙增加到420±104nmol·L-1,而灯盏花素10-6、10-5、3×10-5mol·L-1能进一步加强由氯化钾引起的细胞内游离钙的增加.然而,在无细胞外钙时,灯盏花素对细胞内游离钙却没有影响.结论:灯盏花素通过电压依赖性钙通道加强钙离子内流.     

Both Hypoxic Endothelial Cell Conditioned Medium and Hypoxia Elevate Intracellular Free Calcium in Pulmonary Artery Smooth Mu

ＢｏｔｈＨｙｐｏｘｉｃＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍａｎｄＨｙｐｏｘｉａＥｌｅｖａｔｅＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＦｒｅｅＣａｌｃｉｕｍｉｎＰｕｌｍｏｎａｒｙＡｒｔｅｒｙＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓＨＵＱｉｎｇ－...     

NGF和CgA对RWPE-1细胞内钙离子浓度变化的影响及其在慢性前列腺炎中的作用

目的 探讨神经生长因子(NGF)和嗜铬颗粒蛋白A(CgA)处理后前列腺上皮细胞系RWPE-1细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的差异及NGF和CgA在慢性前列腺炎(CP)发病中的作用.方法 不同浓度的NGF和CgA(50、200 ng/ml)刺激RWPE-1细胞,用激光共聚焦显微镜观察不同浓度的NGF和CgA刺激后细胞内[Ca2+]i变化,加入TRPV1受体拮抗剂后继续观察细胞内[Ca2+]i变化.然后,将正常细胞外液换成D-PBS,再加入NGF和CgA观察细胞内[Ca2+]i变化.结果 50 ng/ml NGF和CgA刺激细胞后,细胞内[Ca2+]i未见明显变化.200 ng/ml NGF和CgA刺激细胞后,细胞内[Ca2+]i明显增加,加入TRPV1受体拮抗剂后,细胞内[Ca2+]i未见明显变化.将正常细胞外液换成D-PBS,用NGF和CgA刺激后,细胞内[Ca2+]i未见明显改变.结论CP的发生可能是通过分泌和释放NGF和CgA,引起前列腺上皮细胞膜TRPV1通道开放,促使细胞内钙离子浓度增加,导致前列腺上皮分泌功能下降所致.     

细胞内游离Ca2+在发育中大鼠皮层神经元无镁诱导惊厥性损伤中的作用

目的: 观察细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)在培养的不同发育阶段皮层神经元无镁诱导惊厥性损伤中的作用,探讨惊厥性脑损伤年龄依赖性的可能机制.方法:体外培养6 d、17 d的胚胎大鼠皮层神经元用无镁细胞外液处理3 h,或于无镁处理前用NMDA(N-甲基-D-门冬氨酸)受体拮抗剂或Ca2+通道阻滞剂预处理,用MTT代谢率测定的方法检测神经元损伤,以Fluo-3作标记用激光共聚焦显微镜扫描的方法检测[Ca2+]i.结果:体外培养6 d、17 d的神经元单纯无镁组MTT代谢率较同期对照组降低.应用MK-801 10 μmol*L-1、AP-5 50 μmol*L-1、尼莫地平10 μmol*L-1预处理后再给无镁处理,培养6 d、17 d的神经元MTT代谢率均不同程度高于同期单纯无镁组.培养6 d、17 d的神经元相对荧光强度之间差异有显著性,两者与基线荧光强度比较差异亦有显著性.应用上述各种拮抗剂后,[Ca2+]i改变的峰值均明显低于同期单纯无镁组.结论: 在体外不同发育阶段的神经元,短暂无镁处理诱导惊厥样放电所引起的神经元线粒体功能损伤以及[Ca2+]i改变程度不同.这种[Ca2+]i改变的年龄依赖性可能是惊厥导致神经元损伤的年龄依赖性的机制之一.NMDA受体-Ca2+通道激活是导致这种[Ca2+]i改变及神经元损伤的关键环节.     

Relationship of Intracellular Free Ca^2＋ Concentration and Calcium-activated Chloride Channels of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells in Rats under Hypoxic Conditions

Hypoxic pul monary hypertension ( HPH) ischaracterized by an elevation of pul monary vascularreaction and pul monary vascular reconstruction.Cytoplasmic free Ca2 concentration ([ Ca2 ]i)plays a key role in the regulation of vascular tone ,pul monary vasoconstriction and proliferation ofsmooth muscle cells[1]. The present study evalua-ted the role of [Ca2 ]iin the regulation of pul mo-nary vascular tone through regulation of calcium-activated chloride (Clca) channels in rats under a-cute h…     

应用共聚焦激光扫描技术研究阿片受体介导胞内Ca^2＋？…

目的 观察阿片激动剂急性和长时程作用于稳定ｉＮＯＳ基因的ＮＧ－ＬＮＣＸｉｎＯＳ细胞,对细胞内游离钙（〖Ｃａ＾２＋〗ｉ）的影响及Ｇ－蛋白的调节作用。方法 应用共聚焦显微镜和荧光探针Ｆｌｕｏ－３,监测单细胞〖Ｃａ＾２＋）ｉ含量。结果 δ－阿片激动剂ＤＰＤＰＥ和吗啡急性刺激细胞诱发〖（Ｃａ＾２＋〗ｉ）增加,纳洛酮对其起番转作用,用百日咳毒素预处理细胞后,吗啡急性激素不能引起〖（Ｃａ＾２＋〗ｉ增加,ＤＰＤ     

Lead Can Inhibit NMDA^—,K^＋—,QA／KA—Induced Increases in Intracellular Free Ca^2＋ in Cultured at Hippocampal Neurons

Objective To examine the effects of Pb2+ on N-methyl-D-aspartate (NMDA)-, K+- and quisqualate(QA)/kainite(KA)-induced increases in intracellular free calcium concentration ([Ca2+]i) in cultured fetal rat hippocampal neurons in order to explain the cognitive and learning deficits produced by this heavy metal. Methods Laser scanning confocal microscopy was used. Results The results clearly demonstrated that adding Pb2+ before or after NMDA/glycine stimulation selectively inhibited the stimulated increases in [Ca2+]i in a concentration-dependent manner. In contrast, Pb2+ treatment did not markedly affect increases in [Ca2+]i induced by an admixture of QA and KA. The minimal inhibitory effect of Pb2+ occurred at 1 μ mol/L, and more than seventy percent abolition of the NMDA-stimulated increase in [Ca2+]iwas observed at 100 μmol/L Pb2+. Evaluation of pb2+-induced increase in [Ca2+]i response to elevating extracellular concentrations of NMDA, glycine or calcium revealed that Pb2+ was a noncompetitive antagonist of both NMDA and glycine, and a competitive antagonist of Ca2+ at NMDA receptor channels. In addition, Pb2+ inhibited depolarization-evoked increases in [Ca2+]i mediated by K+ stimulation (30 μmol/L), indicating that Pb2+ also depressed the voltage-dependent calcium channels. Also, the results showed that Pb2+ appeared to be able to elevate the resting levels of [Ca2+]i in cultured neurons, implying a reason for pb2+-enhanced spontaneous release of several neurotransmitters reported in several previous studies. Conclusion Lead can inhibit NMDA-, K+-, QA/KA-inducod increases in intracellular [Ca2+]i in cultured hippocampal neurons.     

氧化低密度脂蛋白,低氧和5—HT对血管平滑肌细胞5—HT2A受？…

为探讨粥样硬化病变动脉对５－ＨＴ收缩反应增加的机制,观察要样硬化有关因子氧化低密度脂蛋白、低氧、５－ＨＴ对血管平滑肌细胞５－ＨＴ２Ａ受体及其基因表达,以及细胞「Ｃａ＾２＋」ｉ的效应。方法分别将大鼠主动脉平滑肌细胞单独以５０μｇ／ｍｌｏｘＬＤＬ培养８ｈ,２％,低氧处理２４和４８ｈ,１０μｍｏｌ／Ｌ５－ＨＴ处理３０ｍｉｎ,放射配基结合分析测定５－ＨＴ２Ａ受体;ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测受体     

血管钠肽抑制低氧刺激心成纤维细胞c-fos的表达

目的　研究血管钠肽 (VNP)对低氧作用时心成纤维细胞增殖的影响 ,并对其机制进行探讨 .方法　分离纯化乳鼠心成纤维细胞 ,随机分为 4组 :对照组、低氧组 (2 0～ 30m L· L- 1 )、VNP组 (10 - 8～ 10 - 6 mol· L- 1 )和 VNP (10 - 6mol· L- 1 ) +低氧组 .以免疫组织化学染色方法观察各组 c-Fos的表达情况 ,采用激光共聚焦方法测定了 [Ca2 + ]i 水平 .结果　 1低氧组较对照组可以显著升高 Fos样免疫阳性细胞数及染色强度 (P<0 .0 5 ) ;2 VNP预处理心成纤维细胞可以减弱低氧的作用 (P<0 .0 5 vs低氧组 ) ,但 Fos的表达量仍高于对照组 (P<0 .0 5 ) ;3对照组 [Ca2 + ]i 水平无显著变化 ,低氧组 [Ca2 + ]i 水平显著升高 ,而 VNP能使升高的 [Ca2 + ]i 水平较对照组和低氧组显著降低 (P<0 .0 5 ) .结论　 VNP能减弱低氧对心成纤维细胞生长的刺激作用 ,其机制可能与 Ca2 + 等信号转导分子及 c- fos表达有关     

Nerve Growth Factor Inhibits Gd^3＋ -sensitive Calcium Influx and Reduces Chemical Anoxic Neuronal Death

To investigate whether glutamate and voltage-gated calcium channels-independent calcium influx exists during acute anoxic neuronal damage and its possible relationship to neuronal protective function of NGF. In in vitro model of acute anoxia, hippocampal cultures from newborn rats were exposed to 3 mmol/L KCN. Changes of intracellular Ca^2＋ concentration （[Ca^2＋]i） were monitored by con-focal imaging and cell viability was assayed by PI and cFDA staining. The results showed that after treatment with primary hippocampal cultures with 3 mmol/L KCN for 15 min, [Ca^2＋]i was significantly increased 6.27-fold compared to pre-anoxia level and 73.3% of the cells died. When combination of 20 μmol/L MK-801 （glutamate receptor antagonist）, 40 μmol/L CNQX （AMPA receptor antagonist） and 5 μmol/L nimodipine （voltage-gated calcium channel antagonist） （hereafter denoted as MCN） were administrated to hippocampal cultures, levels of [Ca^2＋]i and cell death rate induced by KCN were partially reduced by 35.9% and 47.5% respectively. However, Gd^3＋ （10 μmol/L） almost completely blocked KCN-mediated [Ca^2＋]i elevation by 81.9% and reduced neuronal death by 88.8% in the presence of MCN. It is noteworthy that NGF, used in combination with MCN, inhibited KCN-induced [Ca^2＋]i increase by 77.4% and reduced cell death by 87.1%. Only PLC in- hibitor U73122 （10 μmol/L） abolished NGF effects. It is concluded that Gd^3＋-sensitive calcium influx, which is NMDA （glutamate receptor） and voltage-gated calcium channels-independent, is responsible for acute anoxic neuronal death. NGF can inhibit Gd^3＋-sensitive calcium influx and reduce anoxic neuronal death through activating PLC pathway.     

小檗碱对急性分离成年大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　研究小檗碱对急性分离大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ] i)的影响。方法　采用酶解法分离单个大鼠心肌细胞 ,用钙敏感的荧光指示剂Fluo 3/AM染色 ,以荧光强度 (FI)来代表 [Ca2 + ] i,应用激光扫描共聚焦显微镜实时监测FI的变化。结果　在静息状态下 ,小檗碱 (3～ 1 0 0 μmol/L)对 [Ca2 + ] i 无影响。 3～ 1 0 0 μmol/L小檗碱对KCl 60mmol/L介导的钙内流也无影响。但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)对caffeine 1 0mmol/L引起的钙动员有明显促进作用 (P <0 .0 1 )。结论　小檗碱对于KCl通过电压依赖性钙通道 (VDC)介导的 [Ca2 + ] i 升高无影响 ;但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)可能通过影响RyRs而促进肌浆网 (SR)内钙外流 ,也可能对SR钙摄取 ,钙的跨膜转运及Na+ Ca2 + 交换有抑制作用     

共聚焦激光扫描显微镜技术在研究大鼠海马神经元胞内钙超载中的应用

目的 观察抑制性氨基酸牛磺酸对兴奋性氨基酸谷氨酸所致胞内钙超载的影响。方法 选择Fluo-3／ AM对培养的海马神经元进行着色后,用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)实时 扫描,动态显示海马神经元二维图像,以计算机相应软件对胞内钙的荧光强度变化进行分析统计。结果 在 0.5 mmol／L谷氨酸作用下,胞内钙荧光强度迅速升高(P<0.001);0.5 mmol／L谷氨酸与3 mmol／L牛磺酸共同 作用于海马神经元时,胞内钙荧光强度明显降低(P<0.001);灌流液中去除牛磺酸后,胞内钙荧光强度上升(P <0.001)。结论 抑制性氨基酸牛磺酸可抑制由兴奋性氨基酸谷氨酸所致神经元的胞内钙超载;CLSM以其独 特的优势,在高清晰度地显示海马神经元形态的同时,也可动态地观察活细胞在不同环境下胞内钙的快速变化 以及定量分析。该技术在动态观察和二维图像的高分辨率上比传统测钙方法有更大的优越性。     

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 观察丙氨酰谷氨酰胺二肽（丙谷二肽）对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法 在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝（MTT）比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶（LDH）活性,比色法检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6 (IL-6)、热休克蛋白70 (HSP70)、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 和缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) mRNA的表达。结果 丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1α mRNA的表达增加。结论 丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。     

大鼠肠肌间神经元胃动素受体的表达及胃动素引起神经元内钙信号的机制

目的观察大鼠肠肌间神经元胃动素受体(MTLR)的表达,并探讨胃动素引起神经元内钙信号的机制。方法采用免疫荧光双标技术观察大鼠肠肌间神经元MTLR的表达;应用激光共聚焦显微镜技术检测不同药物处理组胃动素引起的单个神经元内Ca2+荧光强度的变化。结果大鼠肠肌间神经元呈MTLR免疫反应阳性表达;在Hank's液中,10-6mol/L胃动素可引起神经元内Ca2+浓度的显著升高,其峰高(峰值减去静息值)为30.6±3.7,荧光强度相对变化百分比为(100.8±18.4)%。在D-Hank's液(去除细胞外Ca2+)中或用L型钙离子通道阻断剂维拉帕米预处理细胞后,胃动素可轻度升高胞内Ca2+浓度。与单独应用胃动素组相比差异有统计学意义(P<0.05)。当分别用G蛋白拮抗剂NEM和PLC抑制剂Compound48/80预处理细胞后再加入胃动素,胞内Ca2+浓度升高的程度明显降低,与单独应用胃动素组相比差异有统计学意义(P<0.05)。当用PKC抑制剂D-鞘氨醇预处理细胞后,再加入胃动素,其峰高和荧光强度相对变化百分比同单独应用胃动素组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠肠肌间神经元能自身表达MTLR。胃动素可明显升高神经元内Ca2+浓度,胞内Ca2+浓度的升高既源于外钙的内流又源于内钙的释放。外钙的内流主要通过L型Ca2+通道,G蛋白偶联型MTLR-PLC-IP3途径参与细胞内钙的释放。     

灯盏花素抑制去甲肾上腺素-而增强高钾-锈发的细胞内钙升高

目的观察灯盏花素(Breviscapine,Bre)对去甲肾上腺素(NA)、高钾所致的血管平滑肌细胞内游离钙浓度[Caa+]i的影响。方法利用钙荧光指示剂Fura-2／AM负载的家兔血管平滑肌细胞,动态地观察Bre对NA及高钾所诱发[Caa+]i的改变。结果Bre可抑制含Ca2+液中NA所诱发的[Caa+]i的升高,但对高钾所致[Caa+]i的升高却有增强作用。结论Bre可能通过抑制受体依赖性钙通道而降低[Caa+]i,但却能增强电压依赖性钙通道而增高[Caa+]i。     

肺、脑动脉内皮和平滑肌细胞急性缺氧时某些第二信使的变化

目的研究急性缺氧时细胞内第二信使系统的变化。方法培养猪肺、脑动脉内皮细胞与平滑肌细胞,测定在急性缺氧时胞浆游离钙、磷酸肌醇和环核苷酸的变化。结果肺动脉内皮细胞缺氧时有Ｃａ内流增加、ＩＰ３和ｃＡＭＰ无明显变化,ｃＧＭＰ于缺氧４ｍｉｎ升至高峰,随即回降;而脑动脉内皮细胞缺氧时不仅有Ｃａ内流,且有内钙释放、ＩＰ３和ｃＡＭＰ增多,ｃＧＭＰ浓度在缺氧８ｍｉｎ时仍继续上升。肺与脑动脉平滑肌细胞间缺氧时第二信使的变化,仅有ｃＧＭＰ不同。结论内皮细胞的异质性可能与两血管反应性差异有关。     

加巴喷丁对SNL模型大鼠损伤DRG神经元细胞内[Ca2+]i的影响

目的:探讨加巴喷丁对脊神经结扎(SNL)模型大鼠损伤背根神经节神经元胞内游离钙浓度的影响?方法:SD大鼠,雄性35只,4~6周龄,采用左侧L5 SNL术制备大鼠神经病理性疼痛模型?于结扎后15 d采用酶消化法急性分离损伤同侧L5背根神经节神经元(SNL组)和假手术组L5背根神经节神经元(Sham组)?采用流式细胞仪检测10?100和300 μmol/L浓度加巴喷丁对损伤侧L5背根神经节神经元基础及高K+激发胞内游离钙浓度的影响?结果:加巴喷丁剂量依赖性地抑制高钾激发的胞内游离钙浓度的增加(P < 0.05或P < 0.01),但对静息钙无作用?结论:加巴喷丁对神经病理性疼痛大鼠损伤背根神经节神经元高钾激发的钙内流的抑制作用,可能与其抗伤害作用的外周机制相关?     

大电导钾通道对脊髓神经元细胞内游离钙和兴奋性的影响

目的 探讨大电导钾通道(large conductance calcium-activited potassium channel,BK)对脊髓神经元细胞内游离钙 (intracellular free calcium, [Ca2 ]i) 和兴奋性的调节作用.方法 体外培养大鼠脊髓神经元细胞,应用膜片钳技术,观察生理状态下和持续电流去极化条件下BK通道特异性阻断剂Iberiotoxin对神经元[Ca2 ]i和动作电位频率的影响,并采用显微荧光测钙法观察Iberiotoxin对高钾条件下[Ca2 ]i的影响.结果 生理状态下,Iberiotoxin灌流(100 nmol/L)对神经元细胞自发动作电位的频率、[Ca2 ]i无显著影响.持续电刺激去极化后,Iberiotoxin灌流使动作电位频率增加,[Ca2 ]i显著升高.高钾溶液(20 mmol/L KCl)引起神经元[Ca2 ]i升高, 而Iberiotoxin灌流(100 nmol/L) 则使[Ca2 ]i进一步显著升高.结论 生理条件下,BK通道不参与脊髓神经元[Ca2 ]i和兴奋性的调节;但在受持续去极化刺激或在高钾条件下,BK对神经元[Ca2 ]i和兴奋性具有显著的调节作用.