用抗胎肝细胞抗原－1及抗系统分化抗原单克隆抗体分离纯化小鼠造血干细胞

本实验中，首先测定了胎肝细胞抗原－１（ＦＨＣＡ－１）在小鼠低比重骨髓细胞（ＬＤＢＭＣ）上的表达，并依据ＦＨＣＡ－１的表达和麦胚凝集素（ＷＧＡ）亲和力将低比重骨髓细胞分成３个亚群：ＦＨＣＡ－１￣（ｈｉｇｈ）ＷＧＡ￣－，ＦＨＣＡ－１￣（ｌｏｗ）ＷＧＡ￣＋和ＦＨＣＡ－１￣－ＷＧＡ￣＋细胞。在抗ＦＨＣＡ－１抗体加补体处理后，ＦＨＣＡ－１￣（ｈｉｇｈ）ＷＧＡ￣－细胞被清除。以此特性，分离纯化了低比重、分化抗原阴性、ＦＨＣＡ－１￣－细胞，该细胞群中ＷＧＡ￣＋细胞占９０％以上，且该细胞的第１２天脾结节数为全骨髓细胞的９５倍，表明该细胞为高度纯化的多能造血干细胞。     

抗重组人白细胞介素1β单克隆抗体识别相应抗原决定簇的研究

本文对３个抗重组人白细胞介素１β（ｒＨＩＬ－１β）单克隆抗体识别相应抗原决定族的特性进行了研究。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果证明：Ｂ３，Ａ７，Ｅ５３个单克隆抗体识别分子量为１７．５ｋＤ的ＩＬ－１β。竞争性ＥＬＩＳＡ证实，３个抗体识别ＩＬ－β分子上两个抗原决定族。利用此特性，探索了建立双单克隆抗体夹心法检测临床标本中ＩＬ－１β含量的可行性。     

抗巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体的制备及临床初步比对检测

目的：制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体并建立外周血巨细胞病毒抗原血症免疫荧光检测方法。方法 CM V AD169感染人胚胎肺成纤维细胞M RC‐5后24、48、72h ,超声波破碎和甲醛灭活制备CM V抗原,以及CMV pp65重组抗原免疫BALB／C小鼠,标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法,并与进口试剂盒CM V BriteTM Kit进行比对。结果共有两株杂交瘤细胞产生特异性抗体,克隆名称为13D1‐3和29F1‐1,免疫球蛋白亚型分别是IgG1型和IgG2a型,制备的腹水抗体纯化后仍具有良好的免疫学特性。单克隆抗体13D1‐3与 CM V BriteTM Kit试剂盒比对,阳性符合率为88．8％,阴性符合率为98．9％,总符合率为97．3％,Kappa值为0．895,吻合度较高。结论成功制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体,建立以13D1‐3单克隆抗体为基础的检测外周血巨细胞病毒抗原血症方法,与CM V BriteTM Kit试剂盒比对具有良好的符合性。     

小鼠c—kit^＋Sca—1^＋和c—kit^＋Sca—1^—l细胞代表不同分化阶段…

为深入研究造血干细胞的生物功能，根据表面标志，采用流式细胞仪分离和富集了小鼠骨髓中两类不同特征的ＨＳＣ亚群ｃ－ｋｉｔ＾＋Ｓｃａ－１＾＋和ｃ－ｋｉｔ＾＋Ｓｃａ－１＾－细胞。体外集落培养表明ｃ－ｋｉｔ＾＋Ｓｃａ－＾＋细胞对ＩＬ－３ＧＭ－ＣＳＦ单独刺激无反应，而ｃ－ｋｉｔ＾＋Ｓｃａ－１＾－细胞则可形成大小不等的细胞集落。     

HLA—DR基因反义RNA导入脐血干／祖细胞对HLA—DR抗原表达的影响

目的：探讨组织相容性抗原Ⅱ类（ＭＨＣ－Ⅱ）基因反义ＲＮＡ是否可调控脐血细胞ＭＨＣ－Ⅱ类基因的表达及降低脐血细胞的免疫原性和脐血细胞移植时发生移植物抗宿主反应（ＧＶＨＲ）的程度。方法：应用分子克隆技术构建了含人ＨＬＡ－ＤＲβ基因的逆转录病毒表达载体，经过狭缝杂交、电泳、酶切分析鉴定，获得了ＨＬＡ－ＤＲβ基因反义ＲＮＡ重组体，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（脂质体）将重组体导入包装细胞ＰＡ３１７。结果：产重组病毒的细胞ＰＡ３１７的病毒滴度可达１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）可从转染的脐血干细胞中扩增出ＤＲ－β基因ｃＤＮＡ，说明反义ＲＮＡ重组体目的基因已有效表达。用流式细胞仪测定转染的脐血细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原阳性细胞率为２８％（对照组为４５％），其抑制率为３８．２％。结论：导入脐血干细胞的ＨＬＡ－ＤＲ基因反义ＲＮＡ重组体成功地降低了其ＨＬＡ－ＤＲ抗原的表达程度，为临床上降低脐血移植的ＧＶＨＲ提供了理论依据和实验基础。     

P21Cip/WAF1及P27Kip1与增殖细胞核抗原在人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的表达

背景:P21CIp/WAF1、P27Kip1是两种重要的细胞周期的负调控因子,增殖细胞核抗原是反映干细胞增殖的指标.目的:观察体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中P21Cip/WAF1,P27KIp1及增殖细胞核抗原的表达变化.设计、时间及地点:细胞学基因水平观察,于2006-12/2007-06在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成.材料:骨髓来源于中山大学附属第二医院行骨髓穿刺的健康供者.方法:全骨髓贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第5代后,加入含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEM I低血清培养基向肝细胞诱导分化.主要观察指标:诱导后RT-PCR检测细胞内P21Cip/WAF1,P27 KIp1及增殖细胞核抗原基因mRNA的表达.结果:骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导后0,1,3,5,7 d,细胞内P21CIp/WAF1 mRNA表达的相对量逐渐升高(P＜0.01),P27Kip1 mRNA表达的相对量无明显差异(P＞0.05),增殖细胞核抗原mRNA表达的相对量除诱导后0,1 d无明显差异(P＞0.05)外,其余各时间点均逐渐降低(P＜0.01).结论:P21 CIp/WAF1高表达抑制了骨髓间充质干细胞增殖,同时在其向肝细胞分化过程中起一定调控作用,P27KIp1可能并不起作用,增殖细胞核抗原的表达则与P21Cip/WAF1相反,呈逐步减少趋势.     

P21^Cip/WAF1及P27^Kip1与增殖细胞核抗原在人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的表达木术

背景：P21^cip/WAF1, P27^Kip1 是两种重要的细胞周期的负调控因子,增殖细胞核抗原是反映干细胞增殖的指标。目的：观察体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中P21^cip/WAF1, P27^Kip1及增殖细胞核抗原的表达变化。设计、时间及地点：细胞学基因水平观察,于2006-12／2007-06在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。 材料：骨髓来源于中山大学附属第二医院行骨髓穿刺的健康供者。方法：全骨髓贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第5代后,加入含20ug／L肝细胞生长因子、10μg／L成纤维细胞生长因子4的opti-MEM1低血清培养基向肝细胞诱导分化。 主要观察指标：诱导后RT-PCR检测细胞内P21^cip/WAF1, P27^Kip1及增殖细胞核抗原基因mRNA的表达。结果：骨醢间充质干细胞向肝细胞定向诱导后0,1,3,5,7d,细胞内P21^cip/WAF1, mRNA表达的相对量逐渐升高（P〈0．01）,1, P27^Kip1mRNA表达的相对量无明显差异（P〉0．05）,增殖细胞核抗原mRNA表达的相对量除诱导后0,1d无明显差异（P〉0．05）外,其余各时间点均逐渐降低（P〈0．01）。结论：P21^CipANAF1高表达抑制了骨髓间充质干细胞增殖,同时在其向肝细胞分化过程中起一定调控作用,P27Kip1可能并不起作用,增殖细胞核抗原的表达则与P21CipWAF1相反,呈逐步减少趋势。