大鼠骨髓间质干细胞可以成为PEX基因稳定转染的载体细胞吗？*★

背景：PEX基因能够干预恶性胶质瘤的侵袭行为，而骨髓间质干细胞是一种靶向肿瘤治疗的新型细胞载体。 目的：建立稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞。 方法：采用分子克隆技术构建PEX基因真核表达载体，酶切测序鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-PEX，并转染大鼠骨髓间质干细胞，免疫细胞化学法验证真核表达载体在骨髓间质干细胞中的表达。通过G418筛选建立稳定表达PEX基因的骨髓间质干细胞，并用RT-PCR法检测PEX基因的表达。 结果与结论：实验成功构建稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞，基因水平和蛋白水平检测结果表明，PEX在转染的骨髓间质干细胞中呈高表达。     

PEX基因对C6胶质瘤干细胞增殖作用影响的研究

目的探讨PEX基因对大鼠C6胶质瘤干细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用传统的血清培养基培养C6胶质瘤细胞系,再取其单细胞悬液悬浮培养于无血清培养基中传代培养。采用免疫荧光染色分离鉴定脑肿瘤干细胞(BTSCs),应用本实验室成功构建的重组子pDsRed2-C1-PEX以脂质体为介导转染体外培养的BTSCs.RT-PCR验证真核表达载体在BTSCs中的表达。MTT法观察PEX对BTSCs增殖活性的影响,并用流式细胞仪检测胶质瘤干细胞的细胞周期变化。结果成功培养出BTSCs并成功转染,PEX在BTSCs中高表达并且其对体外培养的BTSCs的增殖有明显抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期显示:BTSCsPEX转染组细胞周期G0/G1期细胞百分数明显升高为81.10%,S期细胞百分数明显降低为12.04%,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PEX基因可以在BTSCs中表达,并且能直接抑制体外培养的BTSCs的生长增殖。     

PEX基因修饰人骨髓间质干细胞体外培养鉴定的研究

目的构建PEX基因真核表达载体并转染人骨髓间质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC）,探讨PEX修饰hMSC的可行性。方法采用全贴壁细胞分离法培养hMSC,流式细胞技术鉴定其表面标记物;分子克隆技术构建PEX基因真核表达载体,重组质粒转染hMSC,验证真核表达载体在hMSC中的表达。结果成功培养hMSC并成功构建PEX基因真核表达载体,PEX在转染的hMSC中高表达。结论构建的PEX基因真核表达载体可用于转染hMSC,为进一步探讨其在胶质瘤治疗中的作用奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的

背景：体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。 目的：构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。 方法：构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。 结果与结论：构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞移植对痴呆大鼠记忆功能的影响

背景：一些研究已显示，重组脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞具有向神经样细胞分化的潜能，且能提高脑缺血模型鼠的神经缺失功能。 目的：拟进一步观察脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞移植对阿尔茨海默病鼠学习记忆能力的改善。 设计、时间及地点：随机对照动物观察，于2006-01/2007-06在中山大学一附院神经病学实验室完成。 材料：清洁级8周龄雄性SD大鼠48只，随机分为正常对照组、损伤模型组、基因修饰细胞组、未修饰细胞组，12只/组。另取出生3 d的清洁级SD大鼠10只，用于骨髓间质干细胞的分离培养。 方法：取传至第6代的骨髓间质干细胞，双酶切后亚克隆至pcDNA3质粒，行增强型绿色荧光蛋白基因转染，采用电穿孔法得到重组腺病毒Ad-BDNF，转染293细胞进行病毒包装。除正常对照组外，其余3组大鼠均建立阿尔茨海默病模型。造模后12 d，基因修饰细胞组取重组腺病毒脑源性神经营养因子基因修饰的不含血清骨髓间质干细胞悬液，于伤侧侧脑室坐标前囟后1.6 mm、外侧1.5 mm、腹侧4.0 mm注入8 μL；未修饰细胞组移植等量的单纯骨髓间质干细胞悬液。 主要观察指标：Western blotting法鉴定重组病毒在骨髓间质干细胞中表达，流式细胞仪检测基因感染效率。细胞移植后2周采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力。 结果：Ad-BDNF感染的骨髓间质干细胞存在Mr14 000的脑源性神经营养因子蛋白条带，2 d后约34%骨髓间质干细胞被感染。基因修饰细胞组、未修饰细胞组大鼠平均逃避潜伏期均明显低于损伤模型组（P < 0.01），且前者基本达到正常水平。与损伤模型组寻找平台的运动策略比较，基因修饰细胞组与未修饰细胞组趋向式、直线式显著增多（P < 0.01），边缘式、随机式明显减少（P < 0.01），且前者基本达到正常水平。 结论：移植的骨髓间质干细胞经脑源性神经营养因子基因修饰后，可明显改善阿尔茨海默病模型鼠的记忆能力。     

miR-103a-3p过表达靶向负调控PDK4抑制胶质瘤生长及侵袭

目的 探讨miR-103a-3p过表达对胶质瘤C6细胞恶性生物学行为的影响及对裸鼠移植瘤生长的影响。方法 体外培养鼠源性C6胶质瘤细胞,转染miR-103a-3p mimics质粒过表达miR-103a-3p,转染miR-103a-3p mimics+pcDNA-PDK4质粒分析PDK4过表达对miR-103a-3p过表达的影响;EDU法检测细胞增殖活性;qRT-PCR检测miR-103a-3p、PDK4 mRNA表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Transwell实验检测细胞侵袭能力;免疫印迹法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表达水平。取40只裸鼠,其中20只皮下注射未转染质粒的C6细胞、20只皮下注射转染miR-103a-3p mimics质粒的C6细胞构建移植瘤模型,分析miR-103a-3p mimics过表达对移植瘤生长的影响。结果 生物信息学及双荧光素酶试验证实PDK4是miR-103a-3p的靶点。过表达miR-103a-3p明显降低C6细胞PDK4、Ki67、PCNA、N-cadherin、vimentin表达水平（P<0.05）,明显抑制C6细胞增殖活性、侵袭能力（P<0.05）,明显增加C6细胞E-cadherin表达水平、细胞凋亡率（P<0.05）。过表达PDK4明显抑制过表达miR-103a-3p对C6胶质瘤细胞的作用（P<0.05）。过表达miR-103a-3p明显抑制裸鼠移植瘤生长（P<0.05）,抑制肿瘤组织PDK4、Ki67、vimentin表达（P<0.05）。结论 过表达miR-103a-3p通过靶向抑制PDK4表达,一方面抑制胶质瘤细胞增殖、促进胶质瘤细胞凋亡,从而抑制胶质瘤生长;另一方抑制胶质瘤上皮-间质转化过程,从而抑制胶质瘤细胞侵袭。     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

PDGF-B链基因三链形成寡核苷酸对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的观察PDGF—B链基因三链形成寡核苷酸(triplex—forming oligonucleotide，TFO)对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法应用流式细胞技术观察TFO对C6胶质瘤细胞PDGF—B、PCNA表达的影响，应用流式细胞技术观察TFO对C6胶质瘤细胞凋亡的影响。结果TFO对C6胶质瘤细胞PDGF—B、PCNA的表达有明显抑制作用，而且抑制作用存在浓度依赖性。TFO有明显诱导C6胶质瘤细胞细胞凋亡作用，而且诱导作用存在浓度依赖性。结论TFO抑制C6胶质瘤细胞细胞增殖，同时诱导C6胶质瘤细胞细胞凋亡。     

Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞体外模拟缺血性损伤保护作用的实验研究

目的观察Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞（MSCs）体外模拟缺血性损伤的保护作用，从而为下一步Bcl-2基因修饰的MSCs移植治疗脑缺血的实验研究奠定基础。方法采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs，对培养第5代的MSCs进行鉴定；用脂质体转染法对MSCs行人Bcl-2（hBcl-2）基因转染，转染后用G418进行筛选，然后用免疫荧光细胞化学技术检测其蛋白的表达；采用血清剥夺和缺氧（SOD）处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型，通过流式细胞术和TUNEL原位细胞凋亡检测评价转染hBcl-2基因的MSCs和未转染的MSCs的凋亡及存活情况。结果密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠MSCs，免疫组化检测显示培养的细胞CD44、CD71表达阳性，而CD45表达阴性；转染hBcl-2基因的MSCs经G418筛选后有hBcl-2蛋白的稳定、高效的表达；流式细胞术检测显示和MSCs相比，转染hBcl-2基因的MSCs在SOD后及9h凋亡细胞较少，存活细胞较多。TUNEL原位细胞凋亡检测也显示转染hBcl-2基因的MSCs的凋亡明显减少（P〈0．05）。结论转染hBcl-2基因的MSCs有其蛋白的稳定表达，hBcl-2基因转染可对抗MSCs体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡，从而具有保护性作用。     

胶质瘤转染Cx43cDNA与放疗的协同作用

目的探讨体外培养脑胶质瘤细胞转染Cx43cDNA与放疗是否存在协同作用及该作用与缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的关系。方法LipofectAMINE2000介导质粒DNA转染,G418筛选,半定量RT-PCR及划痕荷载染料传输试验鉴定。分别以MTT法及流式细胞仪检测C6、C6-Non、C6-Cx43细胞放疗组和未放疗组的细胞增殖率及凋亡率,进而观察转染Cx43基因与放疗杀伤胶质瘤细胞是否有协同作用。结果①C6-Cx43细胞Cx43mRNA表达显著增加,染料传输能力较C6-Non明显增强;②转染Cx43cDNA,上调C6细胞GJIC功能后,放疗对脑胶质瘤细胞的毒性作用明显增强。结论①转染Cx43cDNA可上调C6细胞GJIC。②GJIC功能上调后,放疗对脑胶质瘤细胞的毒性作用明显增强,转染Cx43cDNA与放疗存在协同作用。③缝隙连接细胞间通讯可能是肿瘤转染Cx43cDNA与放疗存在协同作用的机制之一。     

PEX基因对C6胶质瘤干细胞MMP-2和VEGF表达的影响

目的 探讨PEX基因对C6胶质瘤干细胞(GSCs)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用血清培养基培养C6胶质瘤细胞系,再取其单细胞悬液悬浮培养于无血清培养基中传代培养.采用单细胞克隆和免疫荧光染色分离鉴定GSCs,运用本实验室成功构建的重组子pDsRed2-C1-PEX,以脂质体为介导转染体外培养的GSCs,逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检验真核表达载体在GSCs中的表达及PEX基因对GSCs表达MMP-2mRNA、VEGFmNA的影响.结果 成功培养出GSCs并成功转染,PEX在GSCs中高表达并且体外对MMP-2、VEGF的表达有明显抑制作用,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PEX基因可以在GSCs中表达,并且体外可以抑制MMP-2和VEGFmRNA在GSCs中的表达,为胶质瘤的治疗奠定理论基础.     

Vascular endothelial growth factor A contributes to glioma-induced migration of human marrow stromal cells (hMSC)

OBJECTIVE: It has been demonstrated that murine neural stem cells (mNSCs) and human mesenchymal stroma cells migrate toward experimental gliomas, making stem cells a candidate for cellular carrier systems of anti-glioma therapy. However, few data are available on the factors involved in regulating stem cell migration. The aim of our study was to characterize the migratory and invasive behavior of adult human marrow stromal cells (hMSC) that interact with glioma cells, especially focusing on vascular endothelial growth factor A (VEGF-A)-mediated effects. METHODS: Human MSC were isolated from bone marrow biopsies carried out for hematological indications. The chemokinetic activity of hMSC in response to glioma-conditioned medium as well as VEGF-A was analyzed using a modified Boyden chamber assay. Invasion of hMSC and glioma spheroids was investigated using confrontational cultures. To provide analogous data from a well-described system, invasion of murine C17.2 neural stem cells was assessed. VEGF-A secretion by gliomas and the expression of VEGF-receptor 2 in hMSC were evaluated. RESULTS: Human MSC showed an extensive invasion into glioma spheroids. Glioma-conditioned medium significantly increased hMSC migration and also invasion, driven by chemotaxis. VEGF-A also showed significant pro-migratory and pro-invasive effects on hMSC, but in a reduced fashion compared to glioma-conditioned medium. CONCLUSIONS: Human MSC show intensive migratory and invasive behavior in the presence of glioma cells and glioma-conditioned medium. Among others, VEGF-A seems to be one important factor in enhancing and directing stem cell motility.     

舒林酸抑制胶质瘤细胞株C6增殖的实验研究

目的观察非甾体类抗炎药舒林酸对胶质瘤C6细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法采用四氮唑蓝（MTT）比色法观察舒林酸对C6细胞增殖的影响，采用流式细胞仪检测舒林酸对C6细胞凋亡和细胞周期分布的影响。结果舒林酸可抑制C6细胞增殖，可诱导细胞凋亡和G0/G1期阻滞，且呈现明显的时间和剂量依赖性（P〈0．05）。结论舒林酸可抑制C6细胞增殖，其机制涉及影响细胞周期和诱导细胞凋亡方面。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对体外培养的C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度塞来昔布分别作用于C6胶质瘤细胞不同时间段,采用甲基噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,并用光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化。结果经不同浓度塞来昔布作用后,C6胶质瘤细胞活性受到抑制,且呈剂量时间依赖性,实验组与对照组之间以及实验组各亚组之间均有显著性差异（P〈0.05）。细胞周期检测发现实验组S期细胞减少,G2期细胞显著增加,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;同时,塞来昔布还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在实验组与对照组之间有显著性差异（P〈0.05）。结论选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布可抑制C6胶质瘤细胞增殖,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

Neuronal and glial differentiation of neuroblastoma and glioma cells by Rho inhibitory bacterial exo-enzyme C3

Exoenzyme C3 (C3) produced by Clostridium botulinum type C and D strains specifically modifies the small GTP-binding protein Rho. It has been reported that C3 induces neuronal differentiation of the PC12 cell, an adrenergic cell line. In this study, the effects of C3 on a cholinergic cell line (NG108–15) and a glioma (C6) were examined for their differentiation. Treatment of NG108–15 cells and C6 glioma cells with C3 for 3 days induced neurite or process formation. Moreover, treatment by C3 increased the activities of acetylcholine esterase and choline acetyltransferase in NG108–15 cells, and 2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphohydrolase in C6 cells. These results suggest that C3 induces neuronal differentiation of the cholinergic cell as well as the adrenergic cell, and also glial differentiation of the glioma cell.     

VEGF单抗对低氧环境下C6胶质瘤细胞侵袭性的影响

目的 探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）单克隆抗体对低氧环境下C6胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。方法 采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基（对照组）培养C6胶质瘤细胞,加入终浓度为100 μmol/L氯化钴模拟缺氧环境（缺氧组）,然后加入终浓度为0.1（VEGF-1组）、1（VEGF-2组）、10 μg/ml（VEGF-3组）VEGF抗体处理。MTT法测定细胞活性,Transwell技术检测细胞侵袭和迁移能力,免疫印迹法检测粘着斑激酶（FAK）及富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）蛋白及其磷酸化水平。结果 对照组、缺氧组、VEGF-1组和VEGF-2组C6胶质瘤细胞增殖活性无显著差异（P>0.05）,但VEGF-3组细胞活性显著降低（P<0.05）。缺氧组和VEGF-1组C6胶质瘤细胞侵袭能力无显著差异（P>0.05）,但VEGF-2组C6胶质瘤细胞侵袭能力显著增强（P<0.05）。缺氧组、VEGF-1和VEGF-2组C6胶质瘤细胞FAK蛋白表达及其磷酸化水平无显著差异（P>0.05）。缺氧组、VEGF-1和VEGF-2组C6胶质瘤细胞Pyk2蛋白表达亦无显著差异（P>0.05）,但VEGF-2组Pyk2磷酸化水平显著降低（P<0.05）。结论 缺氧条件下,VEGF单抗显著增强C6胶质瘤细胞的侵袭能力,可能与Pyk2磷酸化水平增高有关。     

Inhibitory effects of Pseudomonas aeruginosa mannose-sensitive hemagglutinin on rat C6 glioma cell proliferation

BACKGROUND: Pseudomonas aeruginosa mannose-sensitive hemagglutinin (PA-MSHA) parenteral injection is used as a broad-spectrum immunomodulator. It remains unclear whether PA-MSHA exhibits inhibitory effects on tumor cell growth. OBJECTIVE: To investigate inhibitory mechanisms of PA-MSHA-induced proliferation in rat C6 glioma cells in vitro. DESIGN, TIME AND SETTING: Comparative observation and in vitro experiments were performed at the Key Laboratory of Natural Medicine, Kunming Medical College, China from July 2008 to April 2009. MATERIALS: Rat C6 glioma cell line (Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, China) and PA-MSHA parenteral injection (Beijing Wanteer Bio-Pharmaceutical, China) were used in the present study. METHODS: Rat C6 glioma cells in logarithmic growth phase were harvested in vitro. Adherent monolayer cells were respectively treated with PA-MSHA at final colony-forming units (cfu) of 1 × 108 cfu/mL, 2 × 108 cfu/mL, 4 × 108 cfu/mL, 6 × 108 cfu/mL, and 8 × 108 cfu/mL following 24 hours of conventional culture. MAIN OUTCOME MEASURES: MTT colorimetric assay was utilized to determine the inhibitory rate of C6 glioma cells following treatment with various concentrations of PA-MSHA at different times. Cell apoptosis was detected by fluorescent microscopy following Hoechst 33258 staining. Flow cytometry was used to measure PA-MSHA effects on C6 cell cycle. RESULTS: Inhibitory rate of C6 glioma cells increased with prolonged time and increased dose. Hoechst 33258 staining revealed obvious morphological changes in apoptotic C6 glioma cells. Flow cytometry revealed hypodiploid peaks, i.e., apoptotic peak, and the apoptotic rate in cells during S-phase significantly increased with increased concentrations in the experimental groups. CONCLUSION: With in vitro experiments, PA-MSHA preparations inhibited C6 glioma cell proliferation in a time- and dose-dependent manner. These mechanisms are likely associated with cell apoptosis induction and inhibition of the S phase.