单胺氧化酶抑制药物体外筛选模型的建立

目的：构建一种能用于治疗神经退行性变疾病单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）抑制药物的体外筛选模型。方法：采用紫外分光光度方法,以苄胺或5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）分别作为MAO-B或MAO-A的反应底物,测定其活性,并对MAO浓度、底物浓度、缓冲液浓度、pH值、反应时间和温度等进行优化。结果：研究确定的模型反应体系条件为：在温度37 ℃、酶预孵育时间20 min和反应时间60 min下,测定MAO-B活性最佳条件为100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.6）,MAO和底物苄胺的终浓度分别为0.15 mg/ml和2.00 mmol/L;测定MAO-A活性最佳条件为100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.4）,MAO和底物5-HT的终浓度分别为0.40 mg/ml和5.00 mmol/L。结论：建立了一种MAO抑制药物体外筛选的模型,该模型具有成本低、操作简便等特点,适合于大规模筛选MAO-B和MAO-A的抑制药物。     

PCR技术反应体系镁离子浓度的优化

成功的体外DNA扩增,镁离子浓度的优化是十分重要的。镁离子浓度可以影响到Taq DNA聚合酶的活性、精度及产物的特异性,还可影响模板与PCR产物的解链温度,引物二聚体的形成等,镁离子在PCR技术反应体系中的优化最终要求模板DNA、引物和dNTP能够满足Taq DNA聚合酶结合的镁离子。     

纤维素酶转化淫羊藿苷制备宝藿苷I的研究

目的 研究宝藿苷I的制备工艺。 方法 采用纤维素酶水解淫羊藿苷制备宝藿苷I,以转化率为指标,通过单因素考察pH值、温度、底物的浓度、酶用量、反应时间及金属离子对转化率的影响L9(34),正交试验优化制备工艺;采用MS, 1H-NMR、13C-NMR鉴定水解产物。 结果 酶解反应的最适条件为温度50 ℃、反应介质pH 5.2醋酸-醋酸钠缓冲液,底物浓度为10 mg/mL,酶与底物质量比1∶1,反应时间48 h,钠离子、钙离子、镁离子、锌离子、对酶解反应无显著影响(P>0.05),铁离子对酶解反应有抑制作用(P<0.01);反应产物相对分子质量为514,核磁图谱证实产物为宝藿苷I。结论 纤维素酶水解淫羊藿苷制备宝藿苷I,工艺简单可靠,反应条件温和,适合工业化生产。     

PCR-RFLP技术检测SUMO4基因163A/G多态性的实验条件研究

目的确定PCR-RFLP技术检测小泛素样修饰蛋白4（SUMO4）163A/G多态性的最适实验条件.方法对影响SUMO4基因PCR反应的主要因素设定系列浓度梯度分别进行研究.结果最适变性温度为94℃;最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2＋浓度为1.5mmol/L;最适dNTP浓度为0.25mmol/L;以2.5U为最适Taq酶量;酶切体系为31μL体系中加10μL产物用10U的酶消化.结论最佳实验条件的摸索是进行糖尿病实验研究的关键.     

果胶酶对橄榄出汁率影响的研究

目的：建立果胶酶制取橄榄汁的最佳反应条件,探讨影响实验的多个因素。方法：通过正交设计对酶解反应的酶浓度、酶解温度、酶解时间3个因素在3个水平上进行优化实验,筛选出各反应因素的最佳水平。结果：实验结果表明,最佳的反应条件为果胶酶8U／ml,酶解温度35℃,酶解时间90min。结论：用果胶酶制取橄榄汁可有效地提高出汁率,正交法实验设计高效、快捷,科学性强,值得推广。     

不同理化因素对肌肉疲劳影响的探讨

目的：探讨不同镁离子浓度、不同温度、前负荷对肌肉疲劳的影响及其可能机制。方法：制备蛙腓肠肌标本,在持续通氧灌流任氏液条件下,采用最大刺激强度,连续单刺激经过不同方法处理的蛙腓肠肌,以最大张力下降50％所需时间作为观察肌肉疲劳指标。结果：镁离子浓度为1mmol/L、10mmol/L均可延长蛙腓肠肌达到疲劳的时间,但作用效果不显著,镁离子浓度为5mmol/L对延长最大张力下降50％所需时间具有显著性作用（P＝0．05）。与正常对照组比较,前负荷分别为10g和20g组最大张力下降50％所需时间明显延长（P＜0．05）,但两实验组差异无统计学意义（ P＞0．05）。温度为7℃蛙腓肠肌最大张力百分比下降速率相对减缓,温度为37℃下降速率相对增加。结论：随着镁离子浓度上升,抗肌疲劳时间延长,达最适浓度时,作用最强。适当增加前负荷可延长抗肌疲劳时间,高温比低温更容易诱发肌疲劳。     

啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种可同时检测肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌的多重PCR方法。方法根据已公布的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌16SrRNA基因序列设计三对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果三对引物能分别扩增出特异性的417 bp、364 bp、324 bp目的条带。最佳退火温度为52℃,镁离子浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,引物浓度为0.625μmol/L。在此条件下多重PCR同时检测的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌敏感度均为10 fg。结论本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法,为同时检测啮齿动物中肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌奠定了良好的基础。     

非专一性酶催化壳聚糖水解反应的特性

某些非专一性酶对壳聚糖具有一定的降解作用，具有普遍的壳聚糖酶的活性。α-淀粉酶对壳聚糖的降解作用受温度、底物浓度、酶浓度、反应时间、pH等因素的影响，其最佳反应条件为壳聚糖浓度20g/L，酶浓度4g/L,pH值6.0，反应温度50℃。降解反应初期是以内切的方式进行，所得到的壳寡糖具有较低的分散度。     

提高血氧分压对不同储存期血液红细胞影响的探讨

目的：探讨提高血氧分压在4℃保存条件下对不同储存期红细胞的影响。方法：在无菌条件下，分别对采集0d，7d，14d，21d的库存血进行无菌氧处理以提高血氧分压。分实验组和对照组，测定血液红细胞在提高血氧分压后的血浆游离Hb浓度，血浆K^＋离子浓度，红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）活性。结果：与对照组比较，在4℃保存条件下，血液红细胞在提高血氧分压初期（1—2d），血浆游离Hh浓度和血浆K^＋离子浓度无明显变化（p〉0．05），红细胞SOD活性、红细胞GSH—Px活性有所提高（p〈0．05）；随着储存时间的延长，血浆游离Hb浓度增加、血浆K^＋离子浓度增高（p〈0．01），红细胞SOD活性和红细胞GSH—Px活性降低（p〈0．01）。结论：（1）不同储存期红细胞能保持较高血氧分压和血氧保和度；（2）血液红细胞在提高血氧分压的初期不会产生明显的溶血反应和其它损伤，红细胞抗氧化酶活性有所提高。随着储存时间的延长，红细胞抗氧化酶活性下降，溶血反应加重，存在红细胞膜氧化损伤作用，这与氧自由基攻击红细胞膜发生过氧化反应及红细胞抗氧化酶活性降低有关。     

实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的方法及实验影响条件，为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础。方法在ABI7000 PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品，摸索最佳扩增条件及建立标准曲线，然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本。结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物。TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高。金牌热启动Taq酶，比较普通Taq酶而言。提高了PCR的特异性和敏感性。FQ-PCR的反应条件设定：95℃10min后95℃5s，53℃30s，40循环结束。结论通过摸索与优化实验条件，建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法。     

荧光定量聚合酶链反应在尖锐湿疣诊断中的应用

目的　探讨荧光定量聚合酶链反应 (FQ - PCR)对尖锐湿疣 (CA )的诊断价值。方法　 FQ- PCR检测病理确诊的 CA患者 36份标本和健康人 84份标本 ;FQ- PCR及病理诊断同期检测临床送检病例 2 73份标本 ,并做诊断性试验评价。结果　 36例病理确诊的 CA患者 HPV6和 HPV11的 DNA FQ- PCR全部阳性 ,平均拷贝数为 1.0× 10 7± 1.0× 10 2 / m l;84例健康人 FQ- PCR全部阴性 ,平均拷贝数为 3× 10± 2× 10 / ml。 FQ- PCR与病理诊断符合率为 10 0 % ,CA患者与健康人拷贝数的差异有显著性 (P<0 .0 5 )。FQ- PCR与病理诊断对比得出 :灵敏度为 10 0 % ,特异度为 92 % ,误诊率为 0 .0 8,漏诊率为 0 ,准确度为 98.9% ,阳性预测值为 98.8% ,阴性预测值为 10 0 % ,阳性似然比为 12 .5 ,阴性似然比为 0。结论　 FQ - PCR能准确定量 ,灵敏度高 ,特异性强 ,快速 ,简便 ,可作为尖锐湿疣早期诊断的指标     

实时荧光定量RT-PCR与ELISA检测孕妇血清风疹病毒的比较分析

目的应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术定量检测孕妇血清标本中风疹病毒RNA,并与ELISA法比较其敏感度与特异度,为孕妇早期风疹病毒检测提供迅速准确的方法。方法收集126例已确诊风疹病毒阳性孕妇血清标本与107例女性健康查体者血清标本,同时进行实时荧光定量RT-PCR核酸检测与风疹病毒ELISA法IgM抗体检测,比较两种方法的敏感度与特异度。结果以细胞培养法为金标准,实时荧光定量RT-PCR法敏感度为92.9%,特异度为98.1%。ELISA IgM抗体法的敏感度和特异度分别为97.6%,86.9%。两种方法的敏感度无显著性差异（p〉0.05）,实时荧光定量RT-PCR法的特异度明显高于ELISA IgM抗体法（p〈0.01）。结论实时荧光定量RT-PCR简便快捷、敏感性高、特异性高、定量准确,在临床风疹病毒基因检测中具有很大的应用潜力。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术在肾结核病理诊断中的应用价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术在肾结核病理诊断中的应用价值。方法回顾性收集我院泌尿外科通过后腹腔镜技术或开放技术行肾切除术后石蜡组织标本55例患者的临床资料,以术前尿结核分枝杆菌培养结果为金标准,并结合术后病理诊断结果,将研究对象分为结核肾病组25例(阳性组),非结核肾病组30例(阴性组)。采用Taqman探针法实时荧光定量PCR技术和抗酸染色技术检测每个石蜡组织标本,对比分析两种检测技术在肾结核病理诊断中的诊断效能,绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评估两种方法在肾结核病理诊断中的价值。结果实时荧光定量PCR技术检测的敏感度与抗酸染色技术检测的敏感度分别为80.0%(20/25)和48.0(12/25),前者相比后者敏感度提高了32.0%,差异有统计学意义(χ²=5.556,P=0.018)。荧光定量PCR检测的特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于抗酸染色检测的结果,但两者比较差异均无统计学意义(P>0.05)。荧光定量...     

NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较

目的：建立NDM1基因常规PCR和荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法,并对其检测结果进行比较。方法：设计3对NDM1基因常规PCR与FQ-PCR引物,建立常规PCR与FQ-PCR反应体系和条件,比较2种检测方法的特异性、灵敏度和对模拟临床样品的检测效果。结果：成功建立NDM1基因常规PCR和FQ-PCR检测方法;特异性检测,常规PCR与FQ-PCR检测7种常见病原菌均为阴性;灵敏度检测,常规PCR检测限为10⁶ mL^-1 ,FQ-PCR检测限为10⁴ mL^-1;模拟临床样品检测,常规PCR和FQ-PCR检测结果一致。结论：常规PCR与FQ-PCR均有很好的特异性,FQ-PCR灵敏度比常规PCR高100倍。     

荧光定量PCR技术在小儿尿液巨细胞病毒检测中的应用

目的探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)方法检测尿液巨细胞病毒在儿童CMV感染诊断中的意义。方法分别应用FQ-PCR和ELISA法检测75例确诊或高度怀疑为CMV感染和25例对照儿童尿CMV-DNA和血清CMV-IgM,比较病毒DNA与血清抗体的平行性和敏感性。结果75例确诊或疑诊CMV活动性感染患儿中,检测到CMV-DNA 66例;检测到CMV-IgM 54例。两种方法阳性符合率为77%,FQ-PCR和ELISA法阳性检出率分别为88%和72%,有统计学差异(P<0.05)。结论FQ-PCR法检测尿CMV-DNA对诊断活动性CMV感染具有良好的应用价值。     

实时荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌感染的效果

①目的 应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术准确定量检测临床标本中淋病奈瑟菌基因，同时与金标准—细菌培养法比较其灵敏度和特异度，为临床淋病的诊疗提供依据。②方法 采集l73例病人临床标本，以PE5700全自动PCR扩增分析仪和淋病奈瑟菌实时荧光定量PCR检测试剂盒进行核酸检测。同时，用含PolyViteX的巧克力板对淋病奈瑟菌进行分离，用ATB Expression自动细菌鉴定仪及配套的APINH进行鉴定。③结果 173份临床标本中，荧光定量PCR法示47例淋病奈瑟菌阳性，阳性率为27．2％；细菌培养法示41例淋病奈瑟菌阳性，阳性率为23．7％。与细菌培养法相比，荧光定量PCR法的灵敏度为100％，特异度为95．5％，两者的符合率为96．5％。④结论 荧光定量PCR技术具有简便、快捷、灵敏度高、特异度高、定量准确等优点，在临床检测淋病奈瑟菌中具有良好的应用前景。     

解脲支原体3种检测方法比较研究

目的:比较培养法、聚合酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(FQ-PCR)在解脲支原体检测中的诊断价值和治愈判定价值.方法:对240例疑诊非淋菌性尿道炎(NGU)者,取尿道或宫颈内分泌物,同时进行培养、PCR和FQ-PCR法检测,并对三种方法均阳性的78例患者作治疗后的随访检测.结果:以2种以上(包括2种)检测方法检测的阳性结果为真阳性,2种检测结果均为阴性则定为真阴性.培养法的敏感性为78.57%(88/112),特异性为100%(128/128);PCR的敏感性为96.43%(108/112),特异性为93.75%(120/128);FQ-PCR的敏感性为100%(112/112),特异性为100%(128/128).78例确诊患者经有效治疗后1周、2周、3周随访检测显示:培养法阴转快,1周的阴转率即为100%(78/78);PCR和FQ-PCR阴转均慢,2周后的阴转率分别为69.23%(54/78)和74.36%(58/78).结论:培养法的特异性高,但敏感性低,必然产生假阴性;PCR敏感性高,但特异性稍差,易产生假阳性;FQ-PCR特异性和敏感性均好,适宜于推广运用.但在治愈判定中,培养法的价值更大,PCR和FQ-PCR的作用有限.     

胎盘组织荧光PCR诊断早期先天梅毒的研究

目的评价胎盘组织荧光PCR(VQ—PCR)在先天梅毒早期诊断中的作用。方法对34例梅毒孕妇和30例非梅毒对照孕妇的胎盘和脐带组织进行梅毒螺旋体DNA的荧光定量PCR检测，并与常规临床及血清学综合诊断方法比较。结果34例梅毒孕妇的胎盘组织中，11例荧光PCR为阳性，阳性率为32．35％，30例非梅毒孕妇的胎盘和脐带样本荧光PCR均为阴性；以常规临床及血清学综合诊断方法为标准，则荧光PCR与常规方法结果的灵敏度为82％，特异性100％，约登指数0．82。显示在诊断先天梅毒新生儿时，FQ—PCR至少有不低于常规综合诊断方法的价值。结论与常规临床血清学综合诊断方法相比，荧光PCR均有明显的优势。     

蛋白免疫印迹和荧光-PCR诊断早期先天梅毒研究

目的评价荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和血清IgM抗体蛋白免疫印迹实验（serum IgM western blot,IgM-WB）在新生儿先天梅毒早期诊断中的作用. 方法在知情同意的情况下,选取34例梅毒孕妇及其新生儿和40例非梅毒对照孕妇及其新生儿,分别给予荧光定量聚合酶链反应、血清IgM-WB试验和常规血清学方法（TPPA、RPR、19S-FTA-ABS）,以双盲对照的形式评价上述实验诊断方法和常规实验室检测（临床＋常规血清学方法RPR滴度的比较＋治疗）在先天梅毒早期诊断的作用. 结果 34例孕妇梅毒病例所生的新生儿中,按常规综合诊断方法3例确诊为先天梅毒,6例拟诊为先天梅毒.34例完成妊娠的梅毒孕产妇病例中,孕妇胎盘和脐带组织荧光定量聚合酶链反应11例阳性（9例常规方法诊断为先天梅毒）;新生儿血清IgM蛋白印迹试验10例阳性（9例常规方法诊断为先天梅毒）;40例作为对照的非梅毒孕妇及新生儿各项检查均为阴性. 结论胎盘组织荧光定量聚合酶链反应和血清IgM蛋白印迹试验诊断梅毒,结果显示可能高于现行的常规综合诊断方法的诊断价值,且优于常规综合诊断方法中的任何一种.     

FQ-PCR检测人巨细胞病毒方法的建立及临床初步应用

目的:建立快速、敏感、特异的人巨细胞病毒(HCMV)实时荧光定量聚合酶链(FQ-PCR)反应检测巨细胞病毒.方法:选择HCMV的IE(立早基因)片段,设计出上下游引物和对应的TaqMan探针建立FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒对体系进行优化,建立标准品并制作出标准曲线,进行重复性检测,并以其他微生物为对照进行特异性检测,最后检测50例临床乳汁标本.结果:当HCMV质粒标准品浓度在1010-106 copy/L时,相关系数R＝0.997,相关性良好,各浓度标准品的Ct值变异系数小于5％,重复性较好.其他种类的细菌、病毒均未出现特异性扩增.50例临床乳汁标本中有43例扩增出阳性,检出率为86％(43/50).结论:实时FQ-PCR检测HCMV,具有快速,灵敏,方便的特点,有助于HCMV感染的病理机制和流行病学研究.