人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的 构建可溶性DC-SIGN(sDC-SIGN)原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白.方法 采用PCR方法,从含人DC-SIGN cDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coli BL21 (DE3)诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose 4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1 300 bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符.纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38 000,Western bolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合.结论 获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础.     

可溶性VEGF受体-3原核表达载体的构建与蛋白表达

目的克隆并原核表达可溶性血管内皮细胞生长因子受体-3（sVEGFR-3），用于受体阻断剂的筛选及制备。方法利用RT—PCR技术从人胎盘组织中扩增VEGFR-3胞外Ⅰ-Ⅲ区cDNA片段，通过基因重组技术将该片段克隆至原核表达载体PTrcHis A中，连接产物转化大肠杆菌TOP10，IPTG诱导融合蛋白表达，纯化获得可溶性受体。结果成功构建表达栽体，经IPTG诱导获得大量稳定表达的sVEGFR-3融合蛋白，纯化后获得纯度达到80％以上的可溶性受体。结论大量可溶性VEGFR-3的获得有助于进一步探索肿瘤淋巴道转移的靶向性治疗方案。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定

目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段,利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转化大肠杆菌BL21(DE)3,用异丙基b-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理,用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确,经过表达与纯化,获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性,并能够抑制AGE诱导的内皮细胞NF-kB的表达。结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达,得到大量的复性蛋白;该蛋白具有特异的免疫原性,保持与AGE的结合活性,并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。     

原核表达小鼠可溶性Fas抑制活化诱导的脾细胞凋亡研究

目的 观察原核表达、制备小鼠可溶性Fas用于抑制活化诱导的脾细胞凋亡的效果.方法 通过RT-PCR从小鼠胸腺中扩增可溶性Fas基因,克隆至原核表达载体pET-28a( ),构建pET-sFas重组质粒,转化大肠杆菌BL21,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得高表达的可溶性Fas.经镍柱亲和层析纯化后用于抑制刀豆素A(ConA)刺激下的脾细胞活化诱导凋亡.结果 基因测序、Western-blot鉴定证实为可溶性Fas的原核表达蛋白,该蛋白能抑制小鼠脾细胞在ConA刺激下发生的凋亡[对照组凋亡率(70.3±4.9)%和实验组凋亡率(8.5±0.4.35)%有极显著差异(P<0.01)].结论 原核表达的可溶性Fas能够抑制小鼠脾细胞在ConA刺激下发生凋亡,为进一步抑制活化的T淋巴细胞凋亡及体外大量制备抗原特异性T细胞提供思路.     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

正交试验法优化人参可溶性糖提取条件

目的:对人参可溶性糖的提取条件进行优化。方法:以可溶性糖含量为指标,采用正交实验优选可溶性糖的提取条件。结果:确定人参可溶性糖的提取条件为50mg人参粉末加50mL 80%乙醇,70℃水浴提取2次,每次30min。结论:优选得到的工艺简便易行,稳定性好。可为人参的进一步研究提供参考和依据。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定

目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段，利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性转化大肠杆菌BL21(DE)3，用异丙基b—D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理，用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确．经过表达与纯化．获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性，并能够抑制AGE绣导的内皮细胞NF-κB的表达．结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达．得到大量的复性蛋白；该蛋白具有特异的免疫原性，保持与AGE的结合活性．并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。     

人可溶性TRAIL蛋白表达及纯化条件优化

目的：优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7．4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0．2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。     

分泌癌胚抗原肿瘤靶向性Cu,Zn—SOD的基因克隆及表达

将Cu，Zn-SOD与抗癌胚抗原（CEA）单链抗体基因（ScFvgene)融合，重组到含T7启动子的表达载体p ET-22b(＋）中，构建表达质粒pETSOD－ScFv，并转化大肠杆菌BL21（ED3），进行了高效表达，表达物占菌体可溶性总蛋白的18％。SDS－PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达物相对分子质量为41kD，与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在磊肠杆菌中为分泌型表达，有利于纯化。RIA测定表明产物能特异性地与抗原CEA结合，邻苯三酚法测定也表明产物具有SOD酶的活性，该融合蛋白为分泌CEA肿瘤的靶向性治疗及放疗、化疗后的恢复提供新的途径。     

可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导

 【目的】构建含蛋白转导域（protein transduction domain,PTD）与脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）融合基因的表达质粒,原核表达可溶性TATPTD-Ngb,并鉴定、纯化,检测TATPTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】提取SD大鼠脑组织总RNA,通过RT-PCR法构建编码TATPTD-Ngb的融合基因,克隆入pET28b原核表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析及可溶性鉴定,利用所表达的目的蛋白上的6个组蛋白用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化,将不同浓度纯化的融合蛋白与原代培养皮质神经元共孵育2h,用Western-blot分析融合蛋白的跨膜转导。【结果】成功构建了含有TATPTD-Ngb的原核表达载体,插入片段500bp,成功表达并纯化了可溶性TATPTD-Ngb融合蛋白,相对分子质量约为20k,Westernblot鉴定显示表达蛋白具有抗原性,并具有转导入原代培养皮质神经元的功能,随给予蛋白浓度的增高进入神经元内的融合蛋白量增高。【结论】可溶性融合蛋白TATPTD-Ngb可转导入皮 质神经元，对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。     

抗人Cu／Zn SOD单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人Cu／Zn SOD单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以人Cu／Zn SOD作为免疫原免疫Balb／c小鼠,取其脾细胞与SP2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗人Cu／Zn SOD单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA、斑点ELISA、Western Blot、免疫组化鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、亚型及相对亲和力。结果筛选到一株可稳定分泌抗人Cu／Zn SOD单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H10H4B12,亚型鉴定重链为IgG2a,轻链为kappa链。ELISA法测定腹水效价为1：256,000,抗体相对亲和力为1．101×10^9mol／L。斑点ELISA、Western Blot显示抗体能特异识别免疫原、人肝细胞株HL-7702和人红细胞中的天然Cu／Zn SOD;不与鼠Cu／Zn SOD和人Mn SOD发生交叉反应。免疫组化进一步显示了人Cu／Zn SOD均匀分布于细胞的胞浆中。结论成功制备了抗人Cu／Zn SOD单克隆抗体,为进一步研究其与腹主动脉瘤的关系奠定了基础。     

细胞穿透肽4介导的Cu/Zn SOD对缺氧复氧损伤心肌细胞的影响

目的 评价细胞穿透肽4(又称为蛋白转导结构域4,PTD4)介导的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤(HRI)的影响.方法 用厌氧培养箱[85%氮气(N2),10%氢气(H2),5% CO2]制作大鼠心肌细胞(H9c2)HRI模型,设置HRI组(HRI的细胞培养液中不加任何处理因素),HRI+Cu/Zn SOD组(加入10 μmol/L Cu/Zn SOD)、HRI+PTD4-Cu/Zn SOD组(加入10 μmol/L PTD4-Cu/Zn SOD),另外以正常培养心肌细胞作为正常对照组,孵育30 min后,透射电镜观察心肌线粒体超微结构,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术检测心肌细胞凋亡.结果 PTD4-Cu/Zn SOD组线粒体损伤程度较HRI组有明显改善.与正常对照组比较,HRI组线粒体膜电位明显下降,PTD4-Cu/Zn SOD组线粒体膜电位低于正常对照组,但与HRI组比较明显恢复.HRI+PTD4-Cu/Zn SOD组心肌细胞凋亡指数[(10.20±2.77)%]较HRI组[(28.40±2.41)%]明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 PTD4介导的Cu/Zn SOD可以减轻大鼠心肌细胞的HRI.     

人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响

目的研究人参总皂苷（TSPG）对脐血造血细胞（UCB）红细胞生成素受体（EPOR）表达的影响。方法以25、50、75和100mg／L TSPG刺激脐血单个核细胞24h，采用流式细胞仪检测细胞膜EPOR表达的变化；细胞Elisa实验检测细胞膜EPOR表达量的改变；免疫细胞化学观察细胞EPOR阳性率的变化。结果流式细胞仪检测显示50mg／L TSPG均能提高脐血细胞膜表面EPOR的表达；细胞Elisa实验结果显示50mg／L TSPG能够提高脐血造血细胞膜表面EPOR的表达量；免疫细胞化学观察显示TSPG 50mg／L组单个核细胞的EPOR表达阳性率较对照组显著增高（P〈O．01）。结论适当剂量（50mg／L）的TSPG可增强脐血单个核细胞膜表面EPOR的表达。     

人参总皂苷对PC12细胞分化的影响

目的:研究人参总皂苷(Total saponin ofpanax ginseng,TSPG)诱导PC12细胞神经元性分化的作用.方法:体外培养PC12细胞,观察PC12细胞在TSPG的影响下细胞发生的形态学改变.诱导48 h透射电镜观察突触连接形成情况,72 h利用免疫细胞化学技术,观察TSPG作用后PC12细胞向MA...     

肠道病毒71型VP3结构蛋白的原核表达

目的 利用大肠杆菌原核表达系统优化表达纯化肠道病毒71型(EV71)VP3结构蛋白,为后续单克隆抗体制备及检测试剂盒研发提供前期基础.方法 采用PCR方法扩增EV71病毒VP3基因,将其插入表达载体pET28a(+),构建pET28a-VP3重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,分别在25 ℃、37 ℃下经IPTG诱导表达,重组表达的蛋白产物经凝胶电泳初步分析,比较不同温度诱导表达的蛋白产物.结果 成功构建pET28a-VP3重组质粒,不同温度下诱导表达的蛋白产物在30.5 kDa左右位置均出现目的条带;37 ℃下诱导表达的蛋白超声破碎并离心后,目的蛋白基本位于沉淀中,而25 ℃诱导表达的蛋白产物有少量目的蛋白溶解于上清液中. 结论 在25 ℃或37 ℃下均能利用大肠杆菌原核表达系统有效表达EV71病毒VP3蛋白;37 ℃诱导时蛋白可融性表达低,目的蛋白获取效率较高.     

糖尿病患者血清过氧化脂质、红细胞铜/锌SOD活性变化及临床意义

采用TBA荧光法,微量指血SOD快速测定法,测定了120例糖尿病人的血清LPO值,红细胞Cu/Zn SOD活性,并与正常对照比较。结果证实,糖尿病人血清LPO值升高,红细胞Cu/Zn SOD活性降低,P<0.01有非常显著性差异。其中以糖尿病性血管病变,白内障患者更为显着。结果提示,糖尿病人体内脂质过氧化反应增强;LPO值增高是SOD活性降低和/或氧自由基增高的结果。故LPO值,SOD活性测定对糖尿病多脏器功能损害发生机制的研究有重大意义。     

家族性肌萎缩侧索硬化症血中Cu/Zn SOD及MDA值变化与临床分配研究

目的：探讨家族性肌萎缩侧硬化症患者及家系成员铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）活性和丙二醛（MDA）含量变化及家族性肌萎缩侧索硬化症（FALS）的临床分型。方法：采用生物化学方法测定红细胞内Cu/Zn SOD活性及MDA值。结果：在2个家系中发现6例Cu/Zn SOD活性下降，3例MDA含量增高。结论；在Cu/Zn SOD活性下降的2个家系临床分型可能为肌萎缩侧索硬化症ALS1例，MDA含量增高间接反映Cu/Zn SOD变化。红细胞内Cu/Zn SOD活性测定及MDA含量测定有可能作为ALS1型患者及基因携带者的诊断方法之一，并可用于FALS初步分型及基因检测前的筛查。     

脑血管疾病患者外周红细胞及其胞膜Cu/ZnSOD水平变化的观察

本文报道50名健康人及33例脑血管疾病患者外周红细胞及其胞膜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn SOD放免测定值。结果表明94％患者红细胞胞液Cu/Zn SOD呈极显著性降低(P<0.001),提示缺血性损伤病理过程中红细胞内超氧阴离子自由基(O(_2~-))产生异常,胞外(O(_2~-))可通过RBC膜阴离子通道进入胞内增多,从而引起胞内SOD歧化作用而耗损增加。本文测定18例脑血栓形成患者红细胞膜Cu/ZnSOD含量未见明显变化(0.2>P>0.1),可能由于细胞间隙胞外SOD(EC-SOD)及RBC膜本身具有防御氧自由基作用有关,从而保护了RBC膜Cu/ZnSOD于平衡状态。本文还就其作用机理作了简要论述。     

Pten基因对小鼠胚胎成纤维细胞中Cu/Zn-SOD基因表达的调控

目的 研究Pten基因对抗氧化蛋白Cu/Zn-SOD基因表达的调控,初步探索其调控机制.方法 运用Northern blot比较Pten+/-MEFs与Pten-/-MEFs细胞中基础Cu/Zn-SOD mRNA表达差异,以及0.1 mmol/L H2O2诱导后Pten+/-MEFs与Pten-/-MEFs细胞中Cu/Zn-SOD mRNA表达差异;运用Western blot分析P13K/AKT通路抑制剂LY294002作用Pten-/-MEFs细胞不同时间(30 min,1、2、6、24 h)后,与空白Pten-/-MEFs细胞相比,磷酸化AKT及Cu/Zn-SOD蛋白表达变化;利用Northern blot分析LY294002作用Pten-/-MEFs细胞30 min,1、2、6、24 h后,与空白Pten-/-MEFs细胞相比,Cu/Zn-SOD mRNA表达变化.结果 Pten-/-MEFs细胞中,基础Cu/Zn-SOD mRNA表达水平降低,H2O2诱导的Cu/Zn-SOD mRNA表达明显受到抑制;在LY294002作用Pten-/-MEFs细胞30 min时,AKT磷酸化水平明显降低,2 h时基本没有表达;与此对应,在LY294002作用Pten-/-MEFs细胞30 min时,Cu/Zn-SOD蛋白及mRNA表达均增强,并持续增强至24 h.结论 小鼠胚胎成纤维细胞中,Pten基因可通过拮抗PI3K/AKT信号通路调控Cu/Zn-SOD蛋白及mRNA的表达.