靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

β-arrestin 2 shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,获得稳定低表达β-arrestin 2的人非小细胞肺癌A549细胞并验证敲低效果。方法 查询4对可信的β-arrestin 2敲低序列,将载体质粒pSicoR-GFP线性化,构建目的质粒,转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对阳性结果进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外三种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,导入人非小细胞肺癌细胞A549中,用qRT-PCR检测转染效率。结果 成功构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体质粒,测序比对结果一致。qRT-PCR检测发现一组β-arrestin 2的mRNA表达只有对照组的56%。结论 成功构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,并验证其在人非小细胞肺癌细胞A549中敲低效果显著。     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。     

凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定凋亡蛋白抑制因子Livin基因短发夹状干扰RNA(shRNA)慢病毒我体,以便进一步研究Livin的功能.方法 针对已经筛选确定的Livin基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接、转化,产生pLV-shLivin慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用pLV-shLivin,pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建Livin shRNA的慢病毒栽体LV-shLivin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×108TU/ML.结论 成功构建Livin基因sbRNA慢病毒栽体,为应用RNAi研究Livin功能奠定基础.     

小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体。方法通过体外合成小鼠全长Sema3A c DNA,采用Gateway技术将其基因插入到p Down-m Sema3A-IRES/EGFP质粒中,再交换重组获得重组质粒p LV/EXPNZ-puro-m Sema3A-IRES/EGFP,经过测序鉴定后,包装与浓缩慢病毒载体p LV(Exp)-Puro-CMV-m Sema3A-IRES/EGFP,最后重组慢病毒载体转染293T细胞获得病毒液。结果重组慢病毒载体11 538 bp,测序结果证实Sema3A基因共2 319 bp正确插入带有EGFP的载体中,成功构建小鼠Sema3A基因过表达载体。结论成功构建小鼠慢病毒载体p LV(Exp)-Puro-CMV-m Sema3A-IRES/EGFP,为该基因在特定细胞内过表达株的筛选奠定基础。     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

慢病毒载体介导shRNA的研究进展

RNA干扰（RNAi）通过双链RNA的介导,特异性阻止相关序列的表达,从而导致转录后水平的基因沉默.RNAi广泛存在于真核生物中.慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具,广泛应用于相关的RNAi研究领域,如抗病毒研究、癌症及其治疗、基因治疗.现已发现,慢病毒载体能够介导组织、时间特异的RNAi,在疾病的基因靶向治疗上必有广阔前景.     

人notch1—shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建人notch1—shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR／U6质粒,通过与pLenti6／BLOCK—iT—DEST载体的LR重组,构建notch1—shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导人293FT细胞,包装成慢病毒。用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SH—SY5Y细胞,RT-PCR和Westernblot法检测细胞notch1基因的表达。结果目的序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒,细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1—shRNA慢病毒表达载体LR-ND-A能显著抑制SH-SY5Y细胞notch1基因的表达。结论成功构建人notch1—shRNA慢病毒表达载体。     

小鼠甲基转移酶EZH2基因慢病毒表达载体的构建及验证

目的 构建小鼠组蛋白H3 K27三甲基转移酶EZH2基因慢病毒载体及鉴定.方法 以携带EZH2 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板,自行设计携带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物PCR扩增出目的基因编码序列,扩增产物用内切酶酶切后定向克隆到慢病毒载体PLenti-eGFP-NEO中,通过PCR、酶切及测序验证载体;将重组慢病毒载体和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G组成的四质粒系统,共转染293T细胞包装成慢病毒,收集含病毒颗粒的细胞上清液,浓缩和纯化后得到高效价的病毒液,转染293T细胞进行效价测定.结果 PCR扩增出约2241 bp的序列,构建的慢病毒载体测序结果与Genebank报道的目的基因序列一致;四质粒系统成功共转染入293T细胞中,在细胞中能够稳定表达,包装出了2.1×108TU/ml的病毒液.结论 成功构建了小鼠EZH2基因慢病毒载体,并得到2.1×108TU/ml高效价的病毒液.     

解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。     

小鼠miRNA-203慢病毒过表达载体的构建及病毒包装与滴度测定

目的构建microRNA-203（miR-203）过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定。方法利用化学合成miR-203发夹前体结构RNA（small hairpin RNAs,hRNA）,并将其克隆入pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组pSicoR-miR-203表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三个质粒共转染到HEK-293T细胞,分别在48h和72h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒尾静脉注射Balb/c小鼠,检测miR-203在小鼠体内的表达与分布情况。结果酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-203重组质粒,并成功的包装成慢病毒,病毒滴度为5×107 TU.mL-1。重组病毒在Balb/c小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有表达。结论成功构建miR-203慢病毒表达载体,获得高效表达miR-203的慢病毒颗粒,为miR-203靶基因筛选及其功能的研究奠定了基础。     

精氨酸甲基转移酶CARM1 shRNA慢病毒表达质粒的构建及稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系的建立

目的 构建慢病毒表达小鼠CARM1基因shRNA的质粒,观察其在小鼠畸胎瘤P19细胞中对CARM1的表达抑制效率.验证CARM1 shRNA慢病毒表达质粒,进一步筛选得到稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系.方法 设计并且合成针对小鼠CARM1 mRNA不同部位的4组shRNA序列,以Age Ⅰ和EcoR Ⅰ克隆入pLKO.1慢病毒载体中,得到含shRNA的慢病毒表达质粒.氨苄青霉素筛选后,DNA测序鉴定结果.鉴定正确的质粒大量制备后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞,包装得到具有感染能力的慢病毒.将含病毒的培养基上清感染P19细胞后,经嘌呤霉素筛选获得CARM1稳定敲低的P19细胞系,并用Western blot法和实时荧光定量PCR进行鉴定.结果 测序鉴定表明4组CARM1 shRNA慢病毒表达质粒构建成功.Western blot法检测和实时荧光定量PCR分析结果显示4组CARM1 shRNA慢病毒表达载体中的2组可有效地抑制小鼠畸胎瘤P19细胞中CARM1基因的表达,即pLKO.1/CARM1 shRNA2、pLKO.1/CARM1 shRNA3有明显的抑制效果.结论 成功构建了针对CARM1基因的shRNA的慢病毒表达质粒并筛选得到稳定敲低CARM1表达的P19细胞系,为进一步研究CARM1基因的功能奠定了基础.     

RECK基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建RECK基因慢病毒载体,为体内外实验研究提供依据。方法PCR技术构建慢病毒载体表达质粒pGC—FU—RECK,PCR鉴定、测序验证RECK基因,并将其和包装质粒pHelperl．0、pHelper2．0共转染293T细胞,包装产生重组慢病毒GC—FU—RECK。结果pGC—FU—RECK中携有正确的RECK基因,并能在293T细胞中表达;能产生重组病毒GC-FU—RECK。结论成功构建了RECK基因的重组慢病毒载体,为研究其在胰腺癌中的生物学功能奠定基础。     

人bFGF重组慢病毒转染BMSCs的实验研究

目的探讨携带人bFGF和GFP基因慢病毒（1enti—bFGF—GFP）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）及不同MOI（multiplicity of infection）的转染效率。方法实验组：带有bFGF和GFP基因慢病毒感染的BMSCs（bFGF—GFP—BMSCs）。空载体组：带GFP基因慢病毒感染的BMSCs（GFP—BMSCs）。空白组：未经感染的BMSCs;ELISA、RT—PCR检测各组细胞培养72h后bFGF的表达。MOI分别为10、30、50转染BMSCs的转染率。结果bFGF—GFP—BMSCs组表达bFGF蛋白量经ELISA、RT—PCR检测均明显高于GFP—BMSCs组和BMSCs组。MOI为10、30、50、的转染效率分别为36．6％、84．2％、98．5％。结论带有bFGF和GFP基因慢病毒成功转染骨髓间质干细胞并表达,为bFGF基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。MOI为50时,BMSCs的转染率超过85．0％。     

携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

RYBP慢病毒表达载体的构建及对结肠癌细胞HCT116增殖的影响

目的 构建RYBP慢病毒表达载体pWPI-RYBP,包装慢病毒颗粒并感染结肠癌细胞HCT116,分析RYBP的表达及对HCT116细胞增殖的影响.方法 用DNA克隆技术在慢病毒表达载体pWPI-IRES-EGFP序列中引入Flag标签及多个单酶切位点序列,改造后的载体命名为pWPI-linker.采用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)从肝癌SK-Hep-1细胞总RNA中扩增RYBP的全长开放阅读框序列,克隆人pWPI-linker载体中,得到pWPI-RYBP.利用人胚肾细胞HEK293T包装重组慢病毒颗粒,分析该慢病毒颗粒感染HCT116细胞的效率、RYBP蛋白的表达,用MTS方法分析RYBP过表达对HCT116细胞增殖的影响.结果 用改造的pWPI-linker载体成功构建慢病毒表达载体pWPI-RYBP包装的慢病毒颗粒能高效感染HCT116细胞,表达出Flag-RYBP融合蛋白.MTS方法分析表明,RYBP的过表达抑制HCT116细胞的增殖,增殖抑制率达26.1％.结论 改建的慢病毒表达载体pWPI-linker带有可供选择的多个单克隆位点和标签蛋白序列,为今后基于pWPI载体的克隆构建和表达蛋白质的分析提供了极大的便利;RYBP慢病毒表达载体pWPI-RYBP的构建为进一步研究RYBP的生物学功能及基因治疗奠定了基础.     

miR-610的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆微小RNA hsa-miR-610并构建其慢病毒表达载体.方法:将PCR扩增得到的miR-610前体序列和pcDNA6.2-GW/EmGFP载体经双酶切后连接产生pcDNA6.2-miR-610真核表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.通过BP反应及LR反应将pre-miR-610克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610.结果:将构建好的慢病毒表达载体导入大肠杆菌Stb13进行扩增,测序表明所构建的载体与预期的完全一致.结论:成功构建了miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610,为深入研究miR-610的生物学功能奠定了基础.