静电纺丝聚乳酸-乙醇酸聚合物膜与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性研究

目的 探索静电纺丝技术制作的聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）膜与大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的生物相容性。方法 体外培养纯化成年大鼠OECs,将细胞接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察静电纺丝PLGA膜上OECs的细胞形态与分布;用CFDA SE荧光染色检测接种后1～5 d内静电纺丝PLGA膜上OECs的增殖情况;以多聚赖氨酸（PLL）包被细胞做对照。将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其与大鼠的组织相容性。结果 体外培养纯化所得的OECs的细胞纯度大于90%。相差显微镜下示OECs在静电纺丝PLGA膜孔隙中的纳米纤维上黏附良好,细胞状态佳,且特异性地沿纳米纤维方向生长。接种后1～5 d内OECs在静电纺丝PLGA膜上均正常增殖,细胞数目与对照组相比差异无统计学意义。静电纺丝PLGA膜局部移植后大鼠无死亡,PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论 静电纺丝PLGA膜具有良好的生物相容性,OECs在其膜上的黏附和增殖状况良好,是有潜力的神经修复组织工程化神经移植物。     

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪-壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪-壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。     

PLGA/鱼皮胶原共轭静电纺丝膜在大鼠体内降解的实验研究*

目的：对一种新型聚乳酸-羟基乙酸(polylactic acid-glycolic acid, PLGA)/鱼皮胶原共轭静电纺丝膜的细胞毒性和体内降解进行初步探讨,为应用于引导骨组织再生(guide bone regeneration, GBR)提供实验依据。方法：以PLGA和医用级鱼皮Ⅰ型胶原为原材料,通过共轭静电纺丝技术制备出高取向性的纳米纤维膜,然后分别检测细胞毒性和大鼠体内的降解过程,初步评价组织学形态与体内降解率。结果：PLGA/鱼皮胶原共轭静电纺丝膜的细胞毒性为1级,符合植入性医用材料的标准。成纤维细胞黏附生长良好,且不能穿过纤维膜生长到膜的对侧。结论：PLGA/鱼皮胶原共轭静电纺丝膜可用作GBR的屏障膜。     

血小板衍生生长因子对骨髓间充质干细胞向成神经细胞分化趋化性迁移的影响

目的初步探讨血小板衍生生长因子（PDGF）对成神经细胞分化不同阶段骨髓间充质干细胞（BMSCs）趋化性迁移的影响。方法密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代。用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和丁羟基茴香醚（BHA）相结合的方法诱导BMSCs向成神经细胞分化,并用特异性标志物进行鉴定,利用Dunn chamber建立体外迁移模型,评估PDGF对不同分化阶段BMSCs定向迁移的影响。结果通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的大鼠BMSCs。诱导组BMSCs变为神经元样细胞,而对照组的BMSCs形态无变化。Dunn chamber分析显示,分化不同阶段的BMSCs对PDGF的趋化程度不同：和对照组相比较,未诱导的BMSCs、预诱导24h和诱导5h的分化细胞的迁移速率得到明显提高（P〈0.05）;而未诱导的BMSCs、维持18h和维持48h的分化细胞的迁移效率明显升高（P〈0.05）。结论 BMSCs可以被诱导分化为神经样细胞;分化不同时期的细胞有不同的迁移能力。     

静电纺丝素纳米纤维对大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用

目的 探讨静电纺丝素纳米纤维对大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响及作用机制.方法 采用静电纺丝技术制备丝素纳米纤维,建立SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面模型,将60只雄性SD大鼠随机分成静电纺丝素纳米纤维治疗组(实验组)和对照组,实验组创面予以静电纺丝素纳米纤维敷料覆盖,对照组创面以无菌纱布覆盖.观察大鼠烫伤创面大体愈合情况,苏木精-...     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

静电纺丝薄膜支架对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

目的 观察静电纺丝薄膜支架对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响。方法 通过静电纺丝法制备薄膜支架,扫描电镜观察薄膜网状结构,通过薄膜支架作为载体,观察其对成骨细胞的增殖、分化并观察细胞骨架的形态变化。结果 扫描电镜显示:静电纺丝薄膜网状结构有利于细胞的黏附;CCK-8细胞增殖检测与碱性磷酸酶活性检测结果显示,培养1 d、4 d、7 d对照组与实验组相比差异均有统计学意义(P<0.05);细胞骨架染色显示静电纺丝组细胞铺展面积增大且数目增多。结论 静电纺丝薄膜支架对成骨细胞增殖、分化以及细胞黏附具有促进作用。     

新型生物活性复合材料RGD-PLGA/HA体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔多肽聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(RGD-PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(RGD-PLGA/HA)、实验B组(PLGA/HA)分别进行体外复合培养,并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的黏附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,实验A组细胞的黏附及增殖能力均强于实验B组。结论兔BMSCs与新型多孔RGD-PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导无血清培养的骨髓基质干细胞向神经细胞分化

目的研究全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子等细胞因子联合诱导体外无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的作用。方法用含2%Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色鉴定其表面标志，用以全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子为主要成分的复合诱导液诱导BMSCs向神经细胞方向分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定诱导后的神经细胞。结果经全反式维甲酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合诱导后的BMSCs表现为神经细胞形态特征，诱导后的细胞可存活14 d以上，免疫细胞化学染色显示NSE和GFAP均有阳性表达，前者阳性率为65.6%，后者阳性率为12.5%。结论全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经细胞。     

成神经细胞分化的骨髓间充质干细胞向干细胞因子的趋化性迁移

目的研究成神经细胞分化不同阶段的骨髓间充质干细胞（BMSCs）向干细胞因子（SCF）的趋化性迁移。方法 Percoll密度梯度离心法分离培养SD大鼠BMSCs,体外传代并扩增纯化,通过免疫荧光染色及多向分化对其进行鉴定。采用碱性成纤维生长因子（bFGF）、丁羟基茴香醚（BHA）联合诱导剂对BMSCs进行成神经细胞诱导,观察分化各时期的细胞形态变化。利用Dunn chamber研究SCF对不同分化阶段BMSCs趋化性迁移的影响。结果 Dunn chamber迁移实验显示,SCF诱导实验组细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组（P〈0.05）,表明SCF对BMSCs具有趋化作用。此外,分化不同状态的BMSCs向SCF的趋化迁移程度也不同。结论 BMSCs可以分化为神经样细胞,其对SCF的趋化性迁移与分化状态密切相关。     

神经元在丝素蛋白材料上的生长发育

目的研究神经元在丝素蛋白材料上的生长发育,为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据。方法从新生大鼠脑室下区（SVZ）分离细胞,培养在柞蚕、家蚕两种丝素蛋白溶液制成的薄膜材料上,分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光染色,并统计不同时间段神经元在丝素材料上的成活率及复杂度。结果神经元在柞蚕丝素薄膜上的成活率和复杂度明显比家蚕丝素薄膜高,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论柞蚕、家蚕丝素薄膜支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;柞蚕丝素薄膜比家蚕丝素薄膜更适合神经元的生长。     

聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

目的:观察聚己内酯(PCL)电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响,评价其作为骨组织工程的支架材料的应用前景.方法:将兔BMSCs与PCL电纺纤维支架材料在培养板内共培养.采用形态学观察、MTT法及ALP检测等方法检测BMSCs在PCL电纺纤维表面的粘附、增殖和分化能力.结果:体外培养的BMSCs能在PCL电纺纤维表面正常粘附和增殖,并且表达较高的碱性磷酸酶活性.结论:PCL电纺纤维适合作为支架材料应用于BMSCs为种子细胞的组织构建.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

负载TGF-β1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1（transforming growth factor—β1,TGF—B。）壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF—B,壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖一丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCsCD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF—β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。     

再生柞蚕丝素蛋白对小鼠间充质干细胞体外生长的支持作用

目的探讨再生柞蚕丝素蛋白对小鼠间充质干细胞体外生长和分化的支持作用。方法采用再生家蚕丝素蛋白、再生柞蚕丝素蛋白、I型胶原、普通细胞培养板为研究对象,观察小鼠间充质干细胞（C3H10T1/2）在这4种生物材料上的黏附、生长及表面抗原的变化。利用光学显微镜观察细胞生长形态,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞仪测定细胞表型。结果再生柞蚕丝素蛋白对细胞生长形态、细胞表面抗原表达均无影响。培养第6天C3H10T1/2细胞在再生柞蚕丝素膜上增殖明显,与其他3种生物材料的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论再生柞蚕丝素蛋白在体外支持C3H10T1/2细胞的黏附、生长,具有很好的组织相容性。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的：比较4种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖性差异。方法采用密度梯度离心法提取大鼠BMSCs ,分别在DMEM-LG培养基、DMEM/F12培养基、DMEM-LG＋10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）与DMEM/F12＋10 ng/mL bFGF培养条件下贴壁培养,观察各代细胞的形态特征,绘制第4代细胞的生长曲线,利用流式细胞仪对各培养条件下的BMSCs进行细胞表面标志CD45、CD29和CD90的检测。结果不同培养条件下的 BMSCs 生长速度不同。加入 bFGF 培养条件下细胞增殖速度较单用 DMEM -LG 或DMEM/F12培养条件下更快（P＜0．05）。 DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF的培养效果最佳,细胞密度高,生长状态良好。4种条件下培养的细胞均阳性表达CD29及CD90,阴性表达CD45。结论短期培养过程中加入bFGF不引起BMSCs分化,DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF是较理想的BMSCs培养条件。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

再生多孔丝素膜在创面的降解及对免疫细胞的影响

目的研究再生多孔丝素膜在创伤局部应用后的降解吸收及对免疫细胞的影响。方法取SD大鼠,切除背部皮肤建立创面,面积为2cm×2cm。将125I标记的再生多孔丝素膜覆盖在创伤面,再将切除皮肤的表皮层盖在再生多孔丝素膜上进行缝合。在术后3h和3、6、13、20、27、34、41、48、55d,采用单光子发射计算机断层成像术（SPECT）进行显像,示踪至同位素信号消失。处死大鼠,取创面皮肤经HE染色后对其中的炎症细胞进行分析。脾脏细胞经双色免疫荧光及流式细胞术检测CD3＋CD25＋/CD3＋T细胞的比率。结果大鼠种植再生多孔丝素膜55d,SPECT显像的同位素信号基本消失。创面皮肤下HE染色观察到少量的炎症细胞,未观察到残留丝素成分。实验组脾脏中CD3＋CD25＋/CD3＋T细胞的百分率为（7.34±1.85）%,对照组为（7.18±0.37）%,两者无明显差异（P〉0.05）。结论再生多孔丝素膜创面局部应用可在2个月内完全降解吸收,对免疫细胞的激发作用较小,是一种较为理想的创面修复组织工程材料。     

新生兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的：新生兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养方法,从各方面鉴定体外培养BMSCs的生物学特性。方法：采用贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续细胞的形态学观察。从形态学特征、表面标志物及其具有的向骨、脂肪分化的功能等多方面经行综合鉴定。结果：原代BMSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、呈放射状排列。传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速;可向成骨细胞、脂肪细胞分化。结论：贴壁筛选法可成功分离和培养新生兔的BMSCs,BMSCs能向成骨细胞、脂肪细胞分化,可以作为组织工程中种子细胞的来源。     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。