人体β-防御素hBD-3的cDNA克隆与鉴定

防御素是一类具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,具有抗菌、抗病毒及杀伤肿瘤细胞的多功能效应,其效能强大,且至今尚未发现病菌株对它产生耐药性,有关防御素的基础和临床前应用研究已成为生物医学研究领域的热点之一,深受医学界、药学界瞩目,尤其引人注目的是新近发现的β-防御素.已发现3种人体β-防御素,hBD-1是Bensch等[1]于1995年从肾衰患者血透析液中分离获得的;hBD-2是Harder等[2] 于1997年从银屑病患者病损上皮中分离获得的; 2001年,Harder等[3]又从人体鳞癣皮肤中分离获得hBD-3.有关hBD-1 和hBD-2基因的克隆、表达及其调控已有许多研究报道[4],为开发新一类抗菌药物奠定了一定基础.hBD-3的发现为人体防御素的基础和应用研究注入了新的活力,进一步深入研究人体β-防御素hBD-3基因的表达及其调控机制,建立高效表达具有广谱抗菌活性的人体防御素的生物工程新方法、新技术具有极其重要的意义.本研究利用RT-PCR技术,成功克隆了hBD-3的cDNA片段.     

中国人MBL cDNA的克隆与序列分析

从中国汉族人胎肝组织提取ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了编码含号顺序的全长甘露聚糖结合凝集素肽链的ｃＤＮＡ片段,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,     

人单核细胞趋化蛋白—1（MCP—1）cDNA的克隆和序列测定

人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）是由多种细胞产生的一种趋化因子。它不但能趋化单核细胞还能激活单核细胞，在机体防御。炎症恢复和抗肿瘤等方面起重要作用。本文利用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＭＣＰ－１ｃＤＮＡ，经核鞋酸序列测定，除第１２位密码子为ＴＧＴ与国外报道的ＴＧＣ不同，但编码相同的氨基酸半胱氨酸外，其余序列完全相同。     

斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的　克隆斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并对其进行测序和序列分析。方法　利用简并引物 ,进行RT PCR ,扩增斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果　RT PCR扩增出了一约5 0 0bp的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 95bp。将推导的氨基酸序列作同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着较高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论　克隆获得了斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。     

人白介素1受体拮抗剂的cDNA克隆和原核表达

从活化的正常人外周血单核细胞中提取总ＲＮＡ，经逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得了人白介素１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ）ｃＤＮＡ。经过ＤＮＡ测序分析，发现该片段和国外发表的ＩＬ－１ＲａｃＤＮＡ序列一致，将该目的基因插入ｐＢＶ２２０载体，并转入大肠杆菌ＨＢ１０１中，经热诱导表达重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后发现，菌体超声裂解后，在可溶性上清中有一Ｍ１７０００的特异带，约占菌体可溶性总蛋白的８０％以上     

人B细胞活化相关基因BC-1514全长cDNA的克隆与原核表达

目的 克隆与B细胞活化相关的新基因及其原核表达。方法 采用差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行入活化B细胞cDNA文库的筛选,将所获得的阳性克隆的编码区经PCR扩增后克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,重组质粒经酶切,测序鉴定后转化大肠杆菌BL-21,以IPTG诱导表达融合蛋白。结果 以在活化B细胞高表达的EST32为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库获得一个新的全长为1514bp的cDNA克隆（命名为BC-1514）,重组的BC-1514蛋白可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,其表达量约占细菌总蛋白量的14.3%左右,BC-1514cDNA的GenBank的登录号为AF304442。结论 获得了1条新的与B细胞活化相关的cDNA克隆并在E.coliBL-21中得到了有效表达。     

小鼠补体C3d分子cDNA的克隆及鉴定

目的 获得小鼠C3d分子的cDNA。方法 从小鼠肝细胞提取总RNA，通过RT—PCR扩增出C3d分子的cDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18—T载体，构建C3d—pMD18—T重组质粒，转化大肠杆菌，酶切鉴定后进行序列测定。结果 通过琼脂糖凝胶电泳证明有1．0kb左右的PCR扩增片段，序列测定表明为C3d分子的cDNA。结论 通过RT—PCR法从小鼠肝细胞RNA中成功地扩增到小鼠C3d分子的cDNA，为进一步构建基于C3d分子内佐剂的疫苗奠定了基础。     

人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定

人骨形成蛋白 7(ｈＢＭＰ 7)最早由Ｃｅｌｅｓｔｅ等〔1〕克隆并命名。同年 ,Ｏｚｋａｙｎａｔ等〔2〕从人脑ｃＤＮＡ文库中也筛选出此克隆。以后研究表明 ,ＢＭＰ 7除了诱导成骨外 ,还具有广泛的生物学活性〔3 - 6〕。由于ｈＢＭＰ 7在神经系统及造血组织中的特殊作用 ,故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我们采用自行设计合成的一对特异性引物 ,以骨肉瘤的λｇｔ11噬菌体表达文库为模板 ,通过ＰＣＲ扩增到ｈＢＭＰ 7成熟肽的ｃＤＮＡ。将其克隆入载体ｐＧＥＭ 3ｚｆ( ) ,所获序列与已发表的序列完全一致 ,为进一步对其表达和功…     

人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中，扩增并克隆PD-L1的cDNA，构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果：克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-LI胞外区基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。免疫印迹分析表明，在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白，相对分子质量(Mr)为25000，与理论值的大小相符。该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应。结论：成功地克隆PD-L1基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件。     

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段.方法:采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性.结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合.结论:获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件.     

人黄体松弛素原基因的克隆及在大肠杆菌中的初步表达

为了加速我国基因工程高技术药物的研制，开发新型、具有生物活性功能的人重组松弛素原，利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人黄体组织克隆了松弛素原的编码基因，包括Ｂ和Ａ链以及连接肽（Ｃ肽）。克隆的松弛素原基因进行序列测定后，再亚克隆到原核表达载体ＬＫＢ２，转化大肠杆菌ＢＬ２１，用ＩＰＴＧ诱导表达。结果表明，克隆的松弛素原基因与已发表的基因序列相同，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达蛋白的分子量为２０ｋＤ，为可溶性蛋白，占菌体蛋白的３０％。     

中国人IL—18结构蛋白cDNA的克隆和序列分析

目的克隆人白介素 - 18结合蛋白 (h IL- 18BP)的 c DNA,以研究其结构与功能的关系。方法从中国汉族人的胎盘组织中提取总 RNA,以 RT- PCR方法扩增出全长 5 85个 bp的 IL- 18BP c DNA,将其与表达载体 pc DNA3连接 ,转化大肠杆菌 DH5 α,建立了 h IL- 18BP的 c DNA克隆。结果序列分析表明 ,与国外文献报道的人 IL- 18BP的 c DNA序列完全一致。结论 h IL- 18BP已成功地得到克隆。     

Mannan-binding lectin (MBL)-associated serine protease-1 (MASP-1), a serine protease associated with humoral pattern-recognition molecules: normal and acute-phase levels in serum and stoichiometry of lectin pathway components

The pattern-recognition molecules mannan-binding lectin (MBL) and the three ficolins circulate in blood in complexes with MBL-associated serine proteases (MASPs). When MBL or ficolin recognizes a microorganism, activation of the MASPs occurs leading to activation of the complement system, an important component of the innate immune system. Three proteins are produced from the MASP1 gene: MASP-1 and MASP-3 and MAp44. We present an assay specific for MASP-1, which is based on inhibition of the binding of anti-MASP-1-specific antibody to MASP-1 domains coated onto microtitre wells. MASP-1 was found in serum in large complexes eluting in a position corresponding to ～600 kDa after gel permeation chromatography in calcium-containing buffer and as monomers of ～75 kDa in dissociating buffer. The concentration of MASP-1 in donor sera (n = 105) was distributed log-normally with a median value of 11 μg/ml (range 4-30 μg/ml). Serum and citrate plasma levels were similar, while the values in ethylenediamine tetraacetic acid plasma were slightly lower and in heparin plasma were 1·5 times higher than in serum. MASP-1 was present at adult level at 1 year of age, while it was 60% at birth. In normal healthy individuals the level of MASP-1 was stable throughout a 2-month period. After induction of an acute-phase reaction by operation we found an initial short decrease, concomitant with an increase in C-reactive protein levels, followed by an increase, doubling the MASP-1 concentration after 2 days. The present data prepare the ground for studies on the associations of MASP-1 levels with disease.     

编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探

目的 编码５Ｃ５分化抗原全长ｃＤＮＡ的克隆及功能探索。方法 构建人活化Ｂ细胞株３Ｄ５细胞的λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库，以核苷酸杂交法从ｃＤＮＡ文库中筛选阳性克隆、作核苷酸序列分析，编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ测５Ｃ５ ｍＲＮＡ转录本长度，用ＲＴ－ＰＣＲ检测５Ｃ５ ｍＲＮＡ在不同细胞株的表达，观察单抗５Ｃ５－Ｇ１对３Ｄ５细胞增殖的影响。结果 从人活化Ｂ细胞株３Ｄ５的λｇ     

Deficiency of mannan-binding lectin associated serine protease-2 due to missense polymorphisms

Mannan-binding lectin (MBL) and ficolins distinguish between self, non-self and altered-self by recognizing patterns of ligands on the surface of microorganisms or aberrant cells. When this happens MBL-associated serine protease-2 (MASP-2) is activated and cleaves complement factors to start inflammatory actions. We examined human populations for MASP-2 levels, MASP-2 function and for the presence of mutations in coding exons of MASP2. The MASP-2 levels were lowest in Africans from Zambia (median, 196 ng/ml) followed by Hong Kong Chinese (262 ng/ml), Brazilian Amerindians (290 ng/ml) and Danish Caucasians (416 ng/ml). In the Chinese population, we uncovered a novel four amino-acid tandem duplication (p.156_159dupCHNH) associated with low levels of MASP-2. The frequency of this mutation as well as the SNPs p.R99C, p.R118C, p.D120G, p.P126L and p.V377A were analyzed. The p.156_159dupCHNH was only found in Chinese (gene frequency 0.26%) and p.D120G was found only in Caucasians and Inuits from West-Greenland. The p.P126L and p.R99Q were present in Africans and Amerindians only, except for p.R99Q in one Caucasian. The MASP-2 levels were reduced in individuals with p.V377A present. The MASP-2 present in individuals homozygous for p.377A or p.99Q had a normal enzyme activity whereas MASP-2 in individuals homozygous for p.126L was non-functional.     

睫状神经营养因子的cDNA克隆、表达、纯化及其生物活性鉴定

反转录ＰＣＲ扩增人睫状神经营养因子（ｈｕｍａｎｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏＰｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ｈＣＮＴＦ）ｃＤＮＡ后,克隆进ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌中实现原核高效表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ观察到分子量约为２４ｋＤ的预期表达产物,薄层扫描确定其表达量为２６％,制备电泳和凝胶过滤纯化后纯度达到９８％,生物活件分析表明,表达产物能刺激１０日龄鸡胚背根神经节细胞的生长,促进ＣＦＵ－ＧＭ的增殖。     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景：研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强,但在组织中含量甚微。 目的：克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。 方法：从人胎盘组织中提取信使核糖核酸,根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物,利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列,将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370 bp的条带,脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实,利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。