应用多重PCR-单链构象多态性分析同时检测耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析(multiplexpulymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,multi-PCR-SSCP)方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能.方法 根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物.采用multi-PCR-SSCP技术,一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌.新方法的有效性通过116株临床分离株(70株耐异烟肼,66株耐利福平)的验证.结果 名 Multi-PCR-SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性,以细菌培养和药敏试验结果为金标准.116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变,其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功.与H37Rv标准株相比,46株katG基因突变,14株inhA基因突变,58株rpoB基因突变.38株katG和rpoB,4株inhA和rpoB,4株inhA和katG同时突变,还有2株3个基因都有突变.multi-PCR-SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80%、82%,特异度分别为100%和92%.结论 multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌,有望成为临床指导用药的好方法,为深入研究耐药基凶检测奠定了良好的基础.     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的探讨耐异烟肼结核分支杆菌KatG基因突变在结核分支杆菌耐异烟肼耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应——单链构象多态性(PCR-SSCP)分析72株结核分支杆菌KatG基因突变。其中32株为异烟肼(INH)敏感株,40株为INH耐药株,用PCR-SSCP图谱鉴定扩增产物有无突变,H37RV标准株作对照。结果所有INH敏感株SSCP带谱与对照相同;40株INH耐药株中15株与对照相同,25株有不同程度的差异,INH耐药KatG基因突变或缺失的阳性率为62.5%。结论多数结核分支杆菌耐INH是由于其KatG基因突变所致,用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

88株耐异烟肼分支杆菌耐药模式分析

目的为了探讨近年来耐异烟肼分支杆菌同时耐其他几种抗结核药物的耐药模式提供防治结核病参考。方法采用绝对浓度法对临床分离的181株分支杆菌进行10种药物敏感性试验。结果初始耐药率为19．3％,获得性耐药为55．8％,耐异烟肼及其以上分支杆菌占耐药菌株的37．6％。88株耐异烟肼分支杆菌中耐3种及其以上药物的分支杆菌占85．2％。结论耐异烟肼分支杆菌多数是多重耐菌株,在结核病防治工作中应高度重视,以控制或降低初始和获得性耐药的高耐率。     

用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性

本研究采取的方法是针对耐药性基因突变情况设计相应的探针 ,然后将合成好的寡核苷酸探针点阵 ,并固定于玻璃片表面制作DNA芯片 ,通过杂交的方法对结核分枝杆菌(TB)异烟肼耐药性进行检测。报告如下。一、材料与方法1 TB菌株均由上海市肺科医院提供 ,4 0株耐异烟肼菌株 ,5株异烟肼敏感株 ,1株标准株 (敏感株H3 7RV) ,均已通过常规的耐药性检测。2 DNA制备 :采用本实验室自制的标本前处理试剂盒提取DNA。3 探针及引物设计 :TB基因组中与耐异烟肼有关的基因主要有katG结构基因、inhA调节区域、ahpC调节区域 ,分别根据genebank中每个…     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

异烟肼（INH）作为最主要的一线抗结核药物之一,对其耐药性的研究日益受到重视。国外也有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关,与inhA基因突变也有相关性。我们采用PCR-单链构象多态性分析（PCR—SSCP）方法检测了95株肺结核病人痰标本临床分离株,并对47例结核病人痰标本直接进行KatG基因、inhA基因突变检测,现将结果报告如下。     

结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因检测芯片的研究

目的建立用于检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的基因芯片，并与基因测序和常规药物敏感性试验进行比较，探讨其使用价值。方法根据结核分枝杆菌katG基因突变的规律，设计不同的探针，制备可检测katG基因突变的芯片，并且同时检测药物敏感株和耐药株的katG的变异情况。结果结核分枝杆菌临床分离株共137株，至少耐1种抗结核药物共97株（70．8％）。耐异烟肼的比例为32．8％（45／137）。敏感株katG基因扩增阳性率为100％。耐INH菌株katG的阳性率为88．9％（40／45）。PCR检测katG阳性率为91．1％（41／45）。耐INH菌株katG的缺失率为8．9％。katG315位密码子的突变依次为AAC（32．5％，13／40），ACC（15．0％，6／40），ACA（10．0％，4／40）。ATC（5．0％，2／40）和AGC（5．0％，2／40）。基因芯片检测、药物敏感性试验和基因测序的结果一致。结论本研究建立的检测结核菌katG基因突变的基因芯片技术敏感性高，特异性强，可用于结核菌的快速药物敏感性试验评价。     

结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下：     

探针熔解分析法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的应用和评价

目的 评价PMA技术检测MTB对INH耐药突变的价值,调查INH耐药突变发生特征.方法 MTB标准株H37Rv来自国家结核病参比实验室,1株INH敏感株和1株katG S315TACC突变株来自厦门市疾病预防控制中心,7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株来自深圳慢性病防治中心、河南省疾病预防控制中心、中国人民解放军第309医院和厦门市疾病预防控制中心.707份MTB临床分离株来自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心,126份MTB涂阳痰标本来自厦门市同安区疾病预防控制中心.MTB标准株H37Rv、7株MTB INH耐药株和833份临床标本均采用厦门致善结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒热裂解法提取基因组DNA,1株INH敏感株和1株katG S315T ACC突变株采用AxyPrepTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.熔解曲线分析所检标本与野生型对照在katG315位密码子、inhA启动子区(- 17～-8位点)、ahpC启动子区(-44～-30以及-15 ～3位点)及inhA94位密码子的熔解温度(Tm值)差异判断标本是否发生INH耐药突变.3×105拷贝/反应的野生株和katG S315T ACC突变株以10倍梯度稀释至300拷贝/反应,分析PMA技术的灵敏度.用PMA技术检测7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株,评价特异性,并就其中5种耐药突变进行重复性检验.测序验证PMA技术对833份标本INH耐药性的临床检测效能.结果 PMA技术从核酸提取到结果判断可在3小时内完成,在标准96孔实时PCR仪器上可同时检测46份标本.对野生株和katG S315T ACC突变株的灵敏度均为300拷贝/反应,能够同时区分9种INH耐药相关点突变或缺失,5种耐药突变的Tm值标准偏差均在0.5℃之内.检出的162份突变标本与测序验证结果均一致.临床标本验证突变率为19.4％( 162/833),在所检出的14种INH耐药突变katGS315T( AGC →ACC)、inhA启动子区- 15C→T和katG S315N (AGC→AAC)这3种突变占INH耐药突变标本的83.3％(135/162).结论 PMA技术可快速、灵敏、特异检测结核INH耐药突变.     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼相关基因快速检测的应用研究

目的 利用DNA芯片检测技术直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)相关的耐药基因(rpoB、katG/inhA),评价DNA芯片检测技术临床应用的可行性.方法 对586份涂阳痰标本使用L-J培养并用终点法确定其耐药性,同时利用DNA芯片检测技术检测痰标觋本中结核分枝杆菌的rpoB、katG/inhA常见基因突变位点的突变情况,比对两种方法的检测结果,对不符合的菌株测定其相应DNA序列,评估上述试验的准确性.结果 (1)586份涂阳痰标本,其中3(+)163份、2(+)204份、1(+)217份,培养阳性584份.耐药结果显示,对INH、RFP敏感的菌株分别为361株和327株,耐药菌株分别为223株和247株,其中低浓度耐药、高浓度敏感菌株分别为93株和59株,低浓度、高浓度均耐药菌株分别为130株和188株.(2)耐药基因特异性片段扩增阳性标本367份(62.8%)、阴性217份(37.2%).对INH耐药相关基因(katG/inhA)突变检出率是28.4%,突发发生位点集中在katG315位密码子(89.8%);对RFP耐药相关基因(rpoB)突变检出率是55.9%(137/247),突变发生位点主要在rpoB 531和rpoB 526位密码子,发生率分别是68.6%和16.1%.(3)对L-J药敏结果与DNA芯片检测结果不符的菌株进行DNA序列分析,发现有漏检现象.结论 DNA芯片技术直接检测样本中结核分枝杆菌的相关耐药基因存在可行性,如直接应用于临床样本检测,关键要解决样本中DNA的提取效率、PCR的扩增效率和试验的质量控制.     

RIFO杂交和限制性片段长度多态性检测耐利福平和异烟肼的结核分枝杆菌

目的评价利福平寡核苷酸探针杂交技术（RIFO杂交）和PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）在结核分枝杆菌（MTB）耐利福平（RIF）和异烟肼（INH）快速检测中的应用价值。方法选取121株北京地区MTB菌株，分别采用RIFO杂交技术和PCR—RFLP检测RIF耐药相关基因rpoB核心区和INH耐药相关基因katG315位点突变，并对所有菌株的rpoB基因核心区进行测序验证。结果RIFO杂交检测发现，91，5％（65／71）的RIF耐药株和92．9％（52／56）的耐多药菌株（至少对RIF和INH耐药）存在rpoB基因核心区突变，而RIF敏感株中未发现突变；RIFO杂交与测序结果完全一致，测序结果中有突变的位点在RIFO杂交中均有相应的野生型杂交信号缺失；PCR-RFLP结果显示，INH耐药株中katG315突变率为60.6％（40／66）。结论rpoB基因核心区可作为RIF耐药检测的分子标志及耐多药的筛选指标；RIFO杂交技术是检测MTB耐RIF的快速、准确的实验方法，具有推广及潜在的临床应用价值；PCR—RFLP可检测出大部分INH耐药株，可作为临床INH耐药性检测的辅助手段。     

噬菌体生物扩增法直接检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究

目的利用噬菌体生物扩增法(PhaB法)直接检测痰结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼的耐药性,以建立一种特异性强,敏感性高的MTB药敏试验方法。方法选取临床上初步诊断为耐药肺结核的40例患者痰标本,使用PhaB法直接检测痰MTB对异烟肼的耐药性,同时用绝对浓度法检测异烟肼的耐药性,将两者结果进行比较。结果 40例患者痰标本PhaB法与绝对浓度法异烟肼耐药性检测结果均阳性22例,均阴性11例,两法不相符7例。以绝对浓度法检测结果为判断标准,则PhaB法异烟肼耐药性检测的敏感性、特异性、准确性分别是78.57%(22/28)、91.67%(11/12)、82.50%(33/40);Kappa检验,k=0.63 P=0.00<0.05。结论 PhaB法直接检测痰MTB对异烟肼的耐药性简便快速,具有较高的敏感性、特异性和准确性,且与绝对浓度法有较好的一致性。     

结核分枝杆菌耐多药的基因研究

目的 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 用聚合酶链反应和聚合酶链反应单链构象多态性分析对128株结分村以杆菌临床分离析耐利福平（rpoB)、链霉素（rpsL)和异烟肼（KatG）基因检测。结果 38株 敏感株中,各有1株（206%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;90株耐多药析中,分别有81株（90.0%)、71株（78.9%)和63株（70.0%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;有77株（85.6%)同时测出2种以上耐药基因突变;10株耐其他药物株中,仅有1株测出KatG基因突变。结论 85.6%的耐多药结核分枝杆菌存在2种以上耐药基因突变,且耐药基因突变率与耐药浓度有关。     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

结核分支杆菌耐药分子机制的研究进展

由于化学药物的不合理应用、HIV／AIDS感染流行的影响以及耐药结核病（DR—TB）和耐多药结核病（MDR—TB）逐渐增多，对全球结核病的控制造成了严重威胁。据WHO统计大约46％的结核患者耐一种或多种抗结核药物，因此选择敏感的抗结核药物，合理地联合用药是结核病治疗成功的前提。近年来国内外学者探索结核分支杆菌药物作用靶位点编码基因突变与耐药的关系，陆续发现异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）、吡嗪酰胺（PZA）、氟喹诺酮类（FQ）、乙胺丁醇（EMB）等抗结核药物的耐药分子机制。综述如下。     

耐异烟肼结核分支杆菌分子生物学研究进展

近年来结核病再度流行,耐药结核菌株的出现是重要原因之一。异烟肼作为治疗结核病最主要的一线药物,其耐药率显著上升,我国异烟肼耐药率已达20％以上。结核分支杆菌对异烟肼的耐药机制较为复杂,涉及多个分子靶位,近年来在结核病研究中倍受关注,国内外已有这方面的研究报道。本文对近年来耐异烟肼结核分支杆菌的分子生物学研究进展作一综述。     

结核分支杆菌异烟肼和链霉素耐药基因的杂交检测

异烟肼（INH）、链霉素（SM）作为结核病治疗中最主要的一线抗结核药物，对其耐药性的研究日益受到重视。传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6—8周时间，不能及时指导临床用药。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步认识，认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性。     

结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法的建立

目的建立结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变的快速检测方法。方法根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列，自行设计覆盖rpoB、katG、inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针，并检测临床样品中结核分枝杆菌的基因突变情况，以此来判断耐药结果。结果在56个利福平耐药菌株中，有50个菌株都在rpoB基因上榆出有突变，利福平耐药突变检出率为89．3％（50／56）；有30个利福平敏感菌株rpoB基因上都未检出突变。有58个异烟肼培养的耐药菌株中有47个在katG或inhA基因上检出有突变，异烟肼耐药突变检出率为81．0％（47／58）；有30个异烟肼敏感菌株katG或inhA基因上未检出突变。结论用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核分枝杆菌耐药性的检测。     

结核分枝杆菌利福平耐药基因的检测

以药物敏感试验为标准，应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法对６８例利福平耐药菌株和２０例利福平敏感菌株进行测定，结果８８例结核分枝杆菌均扩增出目标ＤＮＡ条带，１０例非结核分枝杆菌和８例非分枝杆菌未出现目标ＤＮＡ条带，所用引物扩增ｒｐｏＢ基因２１５ｂｐ片段为结核分枝杆菌复合群异性的。     

PCR-SSCP快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株的研究

目的：应用分子生物学方法快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株。方法：通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核、非结核分枝杆菌。结果：98株临床分离株中，经细胞学鉴定93株为结核分枝杆菌复合群，5株非结核分枝杆菌。用引物I、Ⅱ对结核分枝杆菌复合群进行PCR－SSCP析，有81株与标准株有相似图谱。用引物Ⅲ、Ⅳ对非结核分枝杆菌进行PCR－SSCP分析，均显示出与结核分枝杆菌标准株不同的电泳图谱。结论：PCR－SSCP可快速鉴别结核、非结核分枝杆菌。