儿童肾病综合征致病基因筛查策略的探讨

目的 通过儿童散发性肾病综合征（NS）致病基因及其突变特点,探讨儿童NS致病基因的筛查策略。方法 收集复旦大学附属儿科医院肾脏风湿科2011年1月1日至2013年12月31日的所有住院NS患儿的临床资料,依据发病年龄分为先天性NS（3月龄内）、婴儿型NS（～12月龄）、儿童早发型NS（～5岁）和儿童迟发型NS（～14岁）;对儿童早发型和迟发型NS再依据对糖皮质激素（GC）治疗反应分为GC敏感（SSNS）和GC耐药（SRNS）,SRNS又分为初发型和迟发型SRNS。先天性NS行NPHS1、NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ2基因所有外显子和WT1基因8、9外显子直接测序;婴儿型NS行NPHS1、NPHS2、PLCE1基因所有外显子和WT1基因8、9外显子直接测序;儿童早发型和迟发型NS行NPHS2基因所有外显子和WT1基因8、9外显子直接测序,以及NPHS1等8个基因42个常见突变位点的SnapShot分析。结果 238例NS患儿进入本文分析,男139例。①8/10例（80％）先天性NS患儿检出NPHS1基因致病性突变;②12例婴儿型NS患儿检出3例WT1（25.0%）、2例NPHS2（16.7%）和1例NPHS1（8.3%）基因突变;③8/132例（6.1％）早发型NS患儿检出基因突变,均属于初发型SRNS（8/32,25.0%）,其中WT1 3例（9.4％）、NPHS2 2例（6.3%）、NPHS1 2例（6.3%)和INF2 1例（3.1%),19例迟发型SRNS和81例SSNS患儿均未检出相关基因突变;④84例儿童迟发型NS中未检出基因致病性突变。结论 先天性NS、婴儿型NS和儿童早发型NS中的初发型SRNS患儿应是临床基因筛查的对象。NPHS1是本文先天性NS患儿的主要致病基因,推荐在先天性NS患儿行NPHS1基因检测。NPHS1、NPHS2和WT1基因突变频率在婴儿型NS和儿童早发型NS中的初发型SRNS患儿中较高,推荐这些人群中优先选择这3个基因作为目标基因进行筛查。不推荐常规在SSNS和迟发型SRNS患儿中行基因检测。     

散发性激素耐药型肾病综合征患儿30例足细胞基因突变分析

目的分析散发性激素耐药型肾病综合征(SRNS)儿童足细胞基因突变及其特点。方法研究对象为30例散发性SRNS患儿和50例尿检正常的健康志愿者。采用PCR扩增NPHS1、NPHS2和CD2AP基因全部外显子及其周围的部分内含子,WT1基因外显子8和9及其周围的部分内含子;应用DNA序列直接测定法对其PCR产物进行测序。结果在10例应用激素和免疫抑制剂治疗肾病无缓解的SRNS患儿中,发现1例携带WT1基因杂合突变——1180C>T(R394W),1例携带NPHS1基因复合杂合突变——2677A>G(T893A)和*142T>C,1例携带CD2AP基因杂合突变IVS13-137G>A。在20例应用激素或免疫抑制剂治疗肾病缓解的SRNS患儿中,发现4例患儿携带NPHS1基因单杂合突变——928G>A、IVS8+30C>T、IVS21+14G>A和IVS25-23C>T,1例患儿携带CD2AP基因单杂合突变(IVS7-135G>A)。结论对激素和免疫抑制剂均耐药的SRNS患儿需进行足细胞基因突变分析。     

广东地区原发性激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2、CD2AP基因突变筛查

目的 研究广东地区原发性激素耐药型肾病综合征(SRNS)患儿NPHS2和CD2AP基因变异情况,探讨NPHS2和CD2AP基因变异与SRNS发病的关系,为儿童SRNS的临床诊治提供理论依据.方法 随机选取26例广东地区原发性SRNS患儿和20例健康儿童,对其NPHS2基因8个外显子和CD2AP基因18个外显子的PCR产物进行直接测序,所得结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因数据库进行比对,检测基因变异情况.结果 26例患儿中14例SRNS患儿和4例健康对照组儿童存在NPHS2单核苷酸多态性(288C ＞T,954T＞C,1038A＞ G),均为已报道的单核苷酸多态性,但2组之间的基因型和等位基因频率比较差异均无统计学意义(P均＞0.05);所测SRNS患儿中仅有2例检测出CD2AP基因1个内含子区突变(1917 +20C＞G).结论 NPHS2基因变异可能并非中国广东地区SRNS患儿发病的主要机制;CD2AP基因内含子突变可能增加患儿对早发性SRNS和局灶节段性肾小球硬化的易感性,提示内含子可能参与SRNS的发病.     

一个中国汉族人家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因新突变

目的　分析中国汉族人家族性激素耐药型肾病综合征 (SRNS)家系NPHS2基因及突变特点。方法　研究对象为一个中国汉族人家族性SRNS家系中的先证者及其兄和父母 ,对照人群为 5 3例尿检正常成年人。取肾组织做常规光镜检查和 podocin、nephrin、α actinin、WT1表达的检查。提取外周血白细胞基因组DNA ,PCR扩增NPHS2基因 8个外显子 ;应用变性高效液相色谱(DHPLC)分析PCR产物 ,对DHPLC洗脱曲线异常者进行DNA序列测定。结果　先证者及其兄肾脏病理示 :局灶节段性肾小球硬化。先证者肾组织 podocin重组蛋白P35染色弱阳性 ,P2 1染色阴性 ;nephrin、α actinin和WT1染色的范围、定位、分布和荧光强度与对照组无差异。DHPLC示先证者及其父母洗脱曲线异常 ;DNA测序证实先证者为 4 6 7_4 6 8insT与 5 0 3G >A复合杂合突变 ,其父为 5 0 3G >A杂合突变 ,其母为 4 6 7_4 6 8insT杂合突变。结论　首次发现了一中国汉族人家族性SRNS家系中NPHS2基因突变——— 4 6 7_4 6 8insT与 5 0 3G >A复合杂合突变 ,且 5 0 3G >A突变为新发现的突变 ;同时还发现该复合杂合突变引起肾组织中抗 podocin重组蛋白P35的染色明显减弱 ,抗 podocin重组蛋白P2 1的染色阴性。     

汉族慢性肾衰竭儿童6例NPHS2和WT1基因遗传学变异

目的 分析汉族慢性肾衰竭(CRF)儿童NPHS2和WT1基因遗传学变异及其特点.方法 研究对象为6例汉族CRF儿童和50例尿检正常的汉族成年人.分别取其外周静脉血3 mL,提取基因组DNA.应用PCR方法 扩增NPHS2和WT1基因的全部8个外显子及其周围的部分内含子.通过DNA直接测序法和限制性片段长度多态性/PCR分析法对NPHS2和WT1基因进行遗传学变异分析.结果 未发现NPHS2和WT1基因致病突变,但检测到2个NPHS2基因多态性(102G>A和954T>C)和4个WT1基因变异(5′-UTR-7G>T、126C>T、IVS5-9T>C和903A>G).NPHS2基因多态性(102G>A)在6例CRF儿童与对照人群中的基因型频率和等位基因频率比较均无显著性差异(Pa>0.05).3个WT1基因变异(5′-UTR-7G>T、126C>T和903A>G)在100条正常染色体中也有检出,其在6例CRF儿童与对照人群中的基因型频率和等位基因频率比较均无显著性差异(Pa>0.05).1个WT1基因变异(IVS5-9T>C)在1例患儿及其父亲(尿检正常)中检出,为杂合变异,而在100条正常染色体中未检出.结论 IVS5-9T>C为新发现的WT1基因变异, NPHS2和WT1基因突变不是本研究6例汉族CRF儿童的主要致病原因.     

中国南方汉族人3个家族性激素耐药型肾病综合征家系CD2AP和NPHS1基因突变分析

目的 分析中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征(SRNS)家系CD2AP和NPHS1基因突变及其特点.方法 研究对象为A、B、C 3个南方汉族SRNS家系先证者及其父母,A、B 2个家系先证者的姐姐和50例尿检正常的南方汉族成年人.取所有研究对象外周静脉血,提取基因组DNA,PCR方法扩增CD2AP基因全部18个外显子和NPHS1基因全部29个外显子及其周围的部分内含子,对PCR产物直接进行DNA序列测定.结果 在3个SRNS家系先证者未检测出CD2AP基因致病突变.在B家系的先证者检测出NPHS1基因2398C＞T(R800C)杂合突变,先证者父亲亦携带此杂合突变,但先证者母亲及姐姐未发现该突变.在50例对照人群中未发现2398C＞T突变.此外,在3个先证者及50例对照人群还检测出9种已报道的CD2AP基因多态性--IVS4-25G＞A、IVS8-95G＞A、IVS10+36C＞A、IVS10-153A＞T、IVS10-110A＞G、IVS11+82T＞C、1204C＞T、IVS16+24G＞A、IVS17-66T＞C和4种已报道的NPHS1基因多态性--349G＞A、IVS24+36C＞T、3315G＞A和IVS27+45C＞T.结论 在1个中国南方汉族SRNS家系先证者检测出NPHS1基因突变--2398C＞T,证实中国南方汉族人家族性SRNS儿童存在NPHS1基因突变,提示对其需进行NPHS1基因突变分析.     

中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因突变

目的 分析中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征(SRNS)家系NPHS2基因突变及其特点.方法 研究对象为A、B、C 3个南方汉族人SRNS家系先证者及其姐和父母,50例尿检正常的南方汉族成年人作为对照人群.取所有研究对象外周静脉血3 ml,提取基因组DNA,PCR扩增NPHS2全部8个外显子及其周围的部分内含子和启动子全长序列,对PCR产物直接进行DNA序列测定.结果 对3个南方汉族人SRNS家系先证者NPHS2全部8个外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现NPHS2突变,仅在外显子8上检测到1个NPHS2基因多态性(954T＞C).在3个家系的先证者及其姐和父母的NPHS2启动子上检测到6个变异:-1715A＞G、-1709G＞A、-1000A＞T、-670C＞T、-116C＞T和-51G＞T.其中5个变异(-1709G＞A、-1000A＞T、-670C＞T、-116C＞T和-51G＞T)在100条正常染色体中也有检出,它们在SRNS患者中的等位基因频率分别与在对照人群中的等位基因频率比较差异均无统计学意义(P＞0.05);另1个变异(-1715A＞G)在家系C的先证者及其母亲(尿检正常)中检出,为杂合变异,而在100条正常染色体中未发现.-1000A＞T为新发现的NPHS2基因多态性,-1715A＞G为新发现的NPHS2变异.结论 NPHS2基因突变不是本研究3个南方汉族人家族性SRNS家系的主要致病原因.     

WT1����ͻ��������������˥��1����ϵ���Ŵ���ѯ�Ͳ�ǰ�������

目的探讨WT1突变致慢性肾功能衰竭产前基因诊断的方法。方法北京大学第一医院于2007年12月对1例先证者家系进行详细的遗传咨询和基因突变分析,提取患儿母亲第2胎孕20周羊水细胞基因组DNA,根据先证者基因突变分析,PCR扩增相应基因相应外显子检测胎儿突变情况,PCR扩增SRY联合核型分析检测胎儿性别,通过3个X染色体微卫星标记(AR、DXS6797和DXS6807)连锁分析除外羊水中母体细胞污染的可能。结果先证者基因突变分析结果为WT1基因IVS9+5G>A杂合突变,同时合并NPHS2第7外显子g.860A>G杂合突变。核型分析显示,患儿核型为46XY。家系突变分析显示,患儿母亲携带NPHS2第7外显子g.860A>G杂合突变,无WT1基因IVS9+5G>A杂合突变,父亲未发现异常。患儿母亲第2胎产前羊水细胞基因组DNA检测显示,胎儿无WT1和NPHS2相应位点突变。PCR扩增SRY基因和核型分析均显示胎儿为女性,连锁分析显示羊水细胞中无母体细胞污染。结论本研究建立了WT1突变所致慢性肾衰竭产前基因诊断的方法。     

NPHS1基因Fin-minor突变致中国先天性肾病综合征2例报道并文献复习

目的总结2例先天性肾病综合征芬兰型NPHS1基因Fin-minor突变患儿临床资料,提高对该病的认识。方法报道2例先天性肾病综合征患儿的临床特点。对可能致病基因NPHS1、NPHS2、PLCε1、LAMB2、COQ2和LMX1B外显子和WT1基因第8、9外显子,以及外显子相邻附近区域进行直接测序。对该家系相关成员进行NPHS1基因外显子及附近调控区域直接测序,分析突变位点,并文献综述。 结果2例患儿均于出生后1个月内起病,临床表现为肾病综合征。血清病原学检查均为阴性。家系调查未发现家族中有类似疾病的成员。NPHS1、NPHS2、PLCε1、LAMB2、COQ2、LMX1B和WT1基因分析发现,2例患儿存在双NPHS1基因杂合突变,未发现其他基因有致病性突变。1例患儿为NPHS1基因的p.R1109X（c. 3325C>T ,Fin-minor）和IVS26DS-2A>T杂合突变,IVS26DS-2A>T剪切突变为首次报道,其父亲携带IVS26DS-2A>T,其母亲携带p.R1109X。1例患儿为NPHS1基因的p.R1109X （c. 3325C>T ）和p.A1160X （c.3478C>T）杂合突变,其母亲携带p.R1109X突变,未发现p.A1160X突变,其父亲拒绝行NPHS1基因分析。以上发现的突变在100例正常人群中未发现。 结论中国先天性肾病综合征儿童不仅有NPHS1基因突变,而且有经典的Fin-minor突变,为国内首报。本研究新发现的IVS26DS-2A>T剪切突变丰富了NPHS1基因突变谱。     

激素耐药型肾病综合征单卵孪生姐妹WT1基因突变

目的分析1个汉族激素耐药型肾病综合征(SRNS)家系WT1基因突变及其特点。方法研究对象为1个汉族SRNS家系先证者及其单卵孪生姐姐、父母和大姐;健康对照人群为50例尿检正常的汉族成年人。取所有研究对象外周静脉血3 mL,提取基因组DNA,PCR扩增WT1基因全部10个外显子及其周围的部分内含子序列,对PCR产物直接进行DNA序列测定。结果先证者患儿临床表型为不完全型Denys-Drash综合征,其孪生姐姐临床表型为孤立性SRNS。在该对单卵孪生姐妹中均检测到WT1基因1180C>T(R394W)杂合突变,在先证者父母及其大姐和50例健康对照人群未检测到该突变;此外,还在对该孪生姐妹检测到3个相同的WT1基因多态性——126C>T、903A>G和IVS7-32C>A。结论本研究在1个汉族SRNS家系临床表型不同的单卵孪生姐妹中发现了相同的WT1基因R394W杂合突变。