细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E.granulosus）铁蛋白（ferritin）基因序列,进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴铁蛋白基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,待PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,测序表明该基因为562bp。同源性比较结果表明：该基因序列与已发表基因核苷酸序列相比,390bp同源性约为97.7％,推导编码氨基酸序列同源性为97.7％,此基因序列在435bp出现终止密码。结论 测序的铁蛋白基因序列有完整的编码框,为进一步研究其结构和功能,以及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）亲肌肉基因（myophilin）序列并进行序列分析.方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GeneBank公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析.结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,测序表明该基因为573bp;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%.结论测序的亲肌肉基因序列有完整的编码框,可做为包虫病重组抗原的候选基因.     

细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因的克隆和序列分析

目的 对细粒棘球蚴谷胱苷肽S-转移酶基因进行克隆和序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴谷胱苷肽S-转移酶基因的已知序列设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增，将PCR产物纯化后，将其克隆到pGEM-T载体后进行序列测定以及生物信息学分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因，测序表明该基因开放阅读框为660bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％。结论 成功克隆了细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因序列，为其进一步的研究奠定基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段的分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E．granulosus）Eg10基因片段，并进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴，提取总RNA，根据GeneBank公布的细粒棘球蚴Eg10基因片段已知序列，设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段，将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株k10基因片段，测序为938bp，该基因序列与检索基因核苷酸序列同源性为100％，推导编码氨基酸序列同源性亦为100％。结论 测序的k10基因序列有完整的编码框（765bp），对于进一步研究其结构和功能及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,测序表明该片段由717bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100％,推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列,可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白生物信息学的初步分析及其结构和功能预测

目的 应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白(Eg.ferritin)氨基酸序列的结构与功能.方法 利用DNAman、NCBI/BLAST公共数据库对目的基因的同源性进行比较分析.应用DNAstar、Biosun等生物分析软件对铁蛋白的二级结构、抗原表位进行预测分析,应用SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟.结果 检索Eg.ferritin氨基酸序列在其功能区的130AA内同源性为97.7%.不同生物间的同源性平均达40.79%.生物软件预测:Eg.ferritin的分子量约16.7 kD,含非极性氨基酸68个,预测其抗原表位肽段为7N-12E,36H-43V,55S-62H,69Q-76R,82A-89E,102I-107E,117A-124S,129L-136T.结论 Eg.ferritin的结构和功能及其抗原表位的预测对选取有价值的抗原肽段提供了依据.     

细粒棘球蚴中国大陆株谷胱甘肽s-转移酶结构与功能的生物信息学分析

目的 应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株谷胱甘肽s-转移酶(EgGST)氨基酸序列的结构与功能.方法 应用DNAStar、NCBI/BLAST、Bioetm、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析EgGsr的基因序列,推算出其编码的氨基酸序列与其他物种的同源序列,进行多序列同源比对,构建分子进化树;预测二级结构、拓扑结构;同源模建预测三级结构;预测主要抗原表位等.结果 经RT-PCR扩增得到的660bpEgGSIDNA片段,经DNAman分析软件同源性比较发现,与GenBank中检索的EgGST基因序列同源性为99%;EgGST与不同生物间的同源性平均达45%;该基因编码的蛋白分子量为25492.53Da,有219个氨基酸,等电点为7.532,有31个酸性氨基酸,32个碱性氨基酸,52个极性氨基酸和7个非极性氨基酸;有8个抗原表位肽段15G-29R,30E-39C,40S-68R,69G-82Q,83I-90M,91D-120A,121P-133Q,134L-144N.结论 EgGST可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子.     

细粒棘球蚴中国大陆株线粒体苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基因片段，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选基因奠定基础。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴mMDH（线粒体苹果酸脱氢酶）基因的已知序列设计一对引物，采用RT—PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏mMDH基因。将PCR产物纯化后，亚克隆到pGEM—T载体并构建成基因工程菌株后进行序列测定和分析。结果 用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中囤大陆株mMDH基因，测序表明该基因开放阅读框为1017bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％，理论蛋白编码的氩基酸序列同源性为99％。结论 在国内首次获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基囚序列，为进一步构建重组表达基因工程菌株打下良好的基础。     

细粒棘球蚴Eg95全长基因的克隆与在甲醇酵母中的表达

目的 了解我国新疆细粒棘球绦虫表膜蛋白Eg95的全长基因结构及尝试其在甲醇酵母中表达。方法 PCR从细粒棘球蚴头节DNA中扩增含有全长编码区序列(cds)的基因，克隆到T载体中测序。再亚克隆到pMETαA中，构建不带6个组氨酸标签的重组质粒，转化甲醇酵母，分析Eg95全长基因的表达。结果 成功扩增了细粒棘球蚴绦虫1262bp的Eg95全长基因，含有两个内含子，外显子核苷酸序列与Genbank中细粒棘球绦虫Eg95 cds完全—致，但扩增的基因与已知的其他Eg95全长基因存在差别。1μg重组质粒的表达盒转化甲酵酵母PMD16，获得了Eg95基因重组工程酵母10个，其中非同源重组子3个。甲酵诱导非同源重组酵母特异表达出了分子量约为17kDa与Eg95cds编码蛋白接近的蛋白。酵母培养上清SDS-PAGE未见该蛋白条带出现，表达的蛋白可能主要位于酵母表面。结论 克隆到Eg95属于—个基因家族的成员之—，其基因编码区高度保守，含有内含子的全长基因同样可在酵母中进行表达。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)特异性抗原P-29重组蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29氨基酸序列,了解该蛋白的特性,预测其抗原表位,为P-29进一步应用研究提供理论依据。方法应用DNAStar、BIOSUN、EXPASY/SignalP、protparam、psite/softberry生物分析软件对P-29的二级结构、抗原表位、信号肽、极性进行预测分析,用EXPASY/SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟。结果 P-29基因开放阅读框编码一个由238个氨基酸残基组成的多肽,分子式为C1180H1906N324O386S9,其蛋白分子量为27095.58 Da,等电点为5.649,有37个碱性氨基酸,41个酸性氨基酸,68个极性氨基酸和76个疏水性氨基酸,半衰期是30 h,结构稳定,呈亲水性且为带负电荷的酸性蛋白,α-螺旋水平较高,有15个抗原决定簇,无信号肽,有2个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,11个酪蛋白激酶II磷酸化位点及7个微体羧基端目标信号位点。结论根据生物信息学预测的结果表明,P-29可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因(myophilin)的重组质粒进行原核表达、纯化,并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性,为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法对已构建的基因工程菌株myophilin/pGEM-T/JM109进行酶切,获取目的基因。将目的基因亚克隆于表达载体pET28a构建基因工程菌株,筛选阳性表达菌株并进行诱导表达、经SDS-PAGE鉴定重组myophilin蛋白。以纯化的myophilin做抗原免疫小鼠,用Western blot、ELISA对该蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平进行检测。结果成功构建含原核重组表达载体myophilin/PET28a/BL21,并纯化出浓度较高的重组蛋白;ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了一定水平的血清抗体;实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论纯化后的重组蛋白myophilin具有较强的免疫原性,有望作为包虫病候选疫苗进一步研究。     

细粒棘球蚴中国大陆株重组14-3-3蛋白基因的克隆和序列分析

目的对细粒棘球蚴中国大陆株14-3-3蛋白（E.g-14-3-3Pc）基因进行克隆及序列分析,为进一步重组抗原的表达奠定基础.方法根据互联网GeneBank中检索到的E.g-14-3-3Pc序列设计一对PCR引物,用RT-PCR方法以细粒棘球蚴总RNA为模板扩增出目的DNA片段,并克隆于载体pGEM-T,测定其核苷酸序列.结果成功克隆出E.g-14-3-3Pc基因片段,测序证明克隆基因确为E.g-14-3-3Pc.结论成功构建细粒棘球蚴pGEM-E.g14-3-3菌株.     

枸杞多糖对细粒棘球蚴小鼠T淋巴细胞亚群的影响

目的研究枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides,LBPs)对细粒棘球蚴小鼠脾脏T细胞亚群的影响,初步探讨LBP对细粒棘球蚴感染后机体免疫功能变化的影响。方法枸杞多糖溶液皮下给药3次,每次间隔2周,于第3次给药后2周,用细粒棘球蚴原头蚴攻击感染BALB/c小鼠,使用流式细胞仪动态检测给药前后、感染前后不同时间点小鼠脾脏IFN-γ+CD3+T细胞、IL-4+CD3+T细胞占总T细胞的比例以及CD4+/CD8+T细胞的比值变化。结果与给药前比较,枸杞多糖给药后7周,小鼠脾脏分泌IFN-γ的T细胞比例增加,分泌IL-4的T细胞比例减少,CD4+/CD8+的比例明显增加;与感染对照组相比,枸杞多糖能使细粒棘球蚴感染小鼠脾脏分泌IFN-γ的T细胞比例增加(感染后2、15周);分泌IL-4的T细胞比例减少(感染后2、10周),CD4+/CD8+的比例先升高(2、10周),后降低(15、20周)。结论枸杞多糖有正向免疫调节作用,通过促进细粒棘球蚴感染小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1的分化,抑制Th2的分化,发挥抗细粒棘球蚴的作用。     

细粒棘球蚴热休克蛋白70重组抗原的免疫学特性研究

目的鉴定纯化的重组细粒棘球蚴热休克蛋白70(EgHSP70)的免疫学特性。方法对已构建的阳性表达菌EgHSP70/pGEX-6P-1进行大量诱导表达后纯化,用EgHSP70和HSP70/GST作抗原制剂分别免疫小鼠,制备抗血清,通过ELISA法和Western blot法对重组EgHSP70的免疫学特性进行鉴定。结果ELISA法检测结果表明,原头蚴、囊液等天然抗原均可被免疫小鼠血清识别,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot显示免疫小鼠血清能够有效识别重组蛋白,同时重组EgHSP70也可被免疫兔血清识别。结论纯化后的重组蛋白EgHSP70具有较好的免疫原性和抗原性,可望作为包虫病疫苗候选分子,值得进一步深入研究。     

肝包虫囊肿的磁共振诊断

对１０例经手术证实的肝包虫囊肿（又称细粒棘球蚴病）的磁共振成像（ＭＲＩ）进行分析，认为其特征性表现为：囊壁呈光滑厚薄均一的低信号的包膜，在Ｔ２加权像上显示更加清楚；母囊内有数个大小不等的子囊，整个病灶呈多房性似玫瑰花状。本文对肝包虫囊肿与肝内其它囊性占位病变的鉴别诊断进行了探讨。