核酸条码标识法PSA检测试剂盒的研制及验证

目的：建立核酸条码标识法检测前列腺特异性抗原（PSA）的方法,临床血清标本验证灵敏度、特异性等指标,并与试剂盒ELISA及RIA检测结果比较。方法：采用自制免疫磁球和双标记纳米金探针,利用双抗体夹心法原理,将PSA的检测转化为对核酸条码片段的检测,制备核酸条码法PSA检测试剂盒,对45例前列腺癌患者,45例前列腺良性增生患者,15例其它肿瘤患者,30例正常人群血清标本进行验证。结果：临床血清标本灵敏度约92,特异性约为68,假阳性率32,检测平均回收率大于95,批内变异系数（CV）为6.24,重复性平行性良好。与ELISA及RIA进口试剂盒检测结果比较,三法的差异无显著性（P〉0.05）,相关性良好,吻合度强。结论：建立的核酸条码标识PSA检测方法,为超微量蛋白质检测提供一种新的方法。     

复合前列腺特异性抗原的单克隆抗体制备及化学发光法免疫定量检测试剂研究

目的:获得特异性检测复合前列腺特异性抗原(c-PSA)的单克隆抗体配对,建立基于化学发光c-PSA 免疫定量试剂。方法:利用市购c-PSA 抗原免疫6 周龄雌性BALB/ c 小鼠,间接法ELISA 差异筛选抗c-PSA、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、总前列腺特异型抗原(t-PSA)的抗体,抗体配对后化学发光定量检测血清中c-PSA 蛋白。结果:获得抗体配对1A10/7D6-SAE,经c鄄PSA 标准品及临床血清样本初步筛选,该抗体配对适用于基于化学法发光的免疫反应定量检测试剂的开发;血清阳性样本与阴性样本检测结果显示具有统计学意义(P<0.000 1);阳性样本定量结果与Siemens 公司复合前列腺特异性抗原测定试剂盒(直接化学发光法)的相关系数为0.97;线性范围为0郾1 ~ 100 ng/ ml;检测灵敏度为0.005 ng/ ml。结论:成功筛选获得特异性检测c-PSA 的抗体配对,并开发c鄄PSA 化学发光免疫定量试剂,其检测能力与国际主流试剂相当。     

CLIA法检测血清PSA在前列腺疾病诊断中的临床价值

评价血清前列腺特异性抗原 (PSA)在前列腺癌与前列腺增生症 (BPH)鉴别诊断中的意义。采用化学发光免疫法 (CLIA)检测 10名健康志愿者、2 3例前列腺癌患者、6 1例BPH患者、11例BPH伴急性尿潴留患者血清PSA。对其中 16例前列腺癌患者进行 1- 6个月随访检测。结果 :① 10名正常志愿者血清PSA均小于 4μg/L ;前列腺癌组血清PSA明显升高 ,BPH组及BPH伴急性尿潴留组血清PSA亦高于正常 ,后三组间在统计学上均有显著差异性 (P <0 .0 1)。②CLIA法检测血清PSA的鉴别诊断阈值以 2 0 μg/L为低限。③ 16例前列腺癌患者术后 1个月内血清PSA均下降。其中 14例病情稳定者血清PSA下降至正常 ,2例病情恶化者术后 3个月血清PSA迅速回升。血清PSA对鉴别诊断前列腺良、恶性疾病具有重要价值 ,有助于前列腺癌疗效的预测及预后的判断     

抗游离前列腺特异性抗原(f-PSA)单克隆抗体的研制与应用

前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)是目前公认的最有价值的前列腺癌肿瘤标志物。PSA在血清中存在不同的分子形式：游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、前列腺特异性抗原与α1抗糜蛋白酶结合的结合型PSA(PSA-ACT)、前列腺特     

血清t-PSA、f-PSA检测联合99mTc-MDP全身骨显像诊断前列腺癌的临床价值

目的:比较血清前列腺特异抗原(t-PSA)、游离前列腺特异抗原(f-PSA)诊断前列腺癌(PCa)和全身骨显像对PCa骨转移的诊断效能,探讨PSA检测联合全身骨显像诊断PCa的临床价值.方法:回顾性分析33例PCa患者和14例前列腺增生(BPH)患者的血清t-PSA、f-PSA和全身骨显像结果,以病理诊断或临床随访为确诊标准,骨显像结果依照5分法评分(0分:骨显像正常;1分:骨良性病变可能性大;2分:不确定;3分:骨转移可能性大;4分:骨转移明确).比较t-PSA、f-PSA和全身骨显像的ROC曲线下面积和最佳域值点的诊断灵敏度和特异性.结果:t-PSA、f-PSA和全身骨显像的ROC曲线下面积分别为0.686、0.637和0.948,最佳域值点的诊断灵敏度和特异性分别为57.6%、78.6%;84.8%、42.9%,90.0%、82.6%.结论:血清PSA检测联合骨显像可有效地诊断PCa,排除高PSA水平良性病例,避免不必要的创伤检查.     

抗人游离前列腺特异性抗原(f-PSA)单克隆抗体的制备及应用

目的建立产生抗人游离前列腺特异抗原单克隆抗体(f-PSA m Ab)的细胞株,获得抗体后建立抗人f-PSA化学发光免疫分析法(CLIA)并进行应用。方法采用杂交瘤技术获得2株稳定分泌抗f-PSA m Ab的细胞株,将细胞株用转瓶扩大培养并将上清液采用亲和纯化法获得抗体,ELISA测定抗体效价、特异性及表位,表面等离子共振法测抗体亲和力;建立双抗体夹心CLIA,采用标准曲线定量法对该体系进行分析性能评估,同时对426例临床血清样本进行检测[其中130例的总PSA水平在(4～10) ng/mL,为"诊断灰区"],评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性。结果获得抗人f-PSA m Ab的杂交瘤细胞株(f-10-1、f-14-1)。用f-10-1和f-14-1建立的CLIA的检测范围为(0. 1～30) ng/mL,灵敏度为0. 05 ng/mL,检测结果的相对偏差均在±5%内,与癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)及结合态PSA(c-PSA)无交叉反应,该试剂与罗氏试剂相关系数达到0. 99,灰区样本阳性符合率、阴性符合率、总符合率均高于90%。结论成功制备了抗人f-PSA m Ab,建立了特异性定量检测人f-PSA的双抗体夹心CLIA。     

PSA与fPSA联合诊断前列腺疾病的临床研究

评价前列腺特异抗原（PSA）和游离前列腺特异抗原（fPSA)的联合检测在前列腺疾病鉴别诊断中的价值。采用化学发光免疫分析法（CLIA）对前列腺癌患者32例、前列腺增生症患者76例及30名正常人的PSA、fPSA和fPSA/PSA比值进行了检测和分析。结果表明，如果以血清PSA值4ng/mL为阈值，诊断前列腺癌的灵敏度为100％，特异性为50．6％；如果以血清PSA值4ng/mL为阈值，同时结合fPSA/PSA并以16％为阈值，诊断前列腺癌的灵敏度为100％，而特异性则为85．3％。这说明联合检测对提高前列腺癌诊断的特异性有一定的价值。     

氧化型α1抗胰蛋白酶定量检测试剂盒研制及对吸烟男性的检测分析

 目的 介绍一种血清氧化型α1抗胰蛋白酶（Ox-AT）的定量检测方法,并分析吸烟男性血清Ox-AT的表达水平。方法 构建一种以Ox-AT特异性单抗为检测抗体的双抗夹心ELISA法,用纯化的Ox-AT作为标准品定量;分析我国吸烟与非吸烟男性血清中Ox-AT的水平。结果 所建立的双抗夹心ELISA试剂盒检测限为2.58 μg/L,在0～500μg/L浓度范围内R2值0.9955,批间差为11.27%,准确度为88.19%,试剂盒4℃保质期超过6个月;对20对吸烟与非吸烟男性血清Ox-AT进行检测,吸烟组为55.43 ± 49.94 μg/L, 显著高于非吸烟对照组的11.01 ± 12.15 μg/L (p<0.001),两组间α1-AT无显著差异。结论 所建立的ELISA法能用于血清Ox-AT的定量检测;血清Ox-AT可能比α1-AT更适合作为我国COPD的评价指标。     

前列腺特异性抗原ELISA法的建立及临床应用

采用从人精浆中纯化的前列腺特异性抗原（ＰＳＡ），经免疫、融合、筛选，得到两株抗ＰＳＡ抗原的单克隆抗体１Ｈ７和２Ｄ１，并通过免疫组化法鉴定了抗体的特异性。将其配对建立的定量测定血清ＰＳＡ的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法最低检出量为０．５μｇ／Ｌ，孔间平均变异系数为４．４％，批内平均变异系数为５．８％。３５例正常男性血清ＰＳＡ的范围（ｘ±ｓ）为（１．４５±１．２４）μｇ／Ｌ；１１例前列腺癌患者血清ＰＳＡ的范围（ｘ±ｓ）为（２６±２７．２）μｇ／Ｌ。与进口ＰＳＡ－ＥＬＩＳＡ试剂盒检测的总符合率为８３％。     

禽流感 HA 基因密码子优化的 DNA 疫苗构建及其免疫原性的初步研究

 目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素（HA）DNA疫苗并研究其免疫原性。方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam 1203/04株HA（H5-VN HA）基因序列，对这些序列进行密码子优化处理，人工合成优化后的H5-VN HA基因。将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接，并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）信号肽取代H5-VN HA信号肽，构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒，命名为HA-VN.tPA（即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗）。以HA-VN.tPA转染293T细胞，应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达。以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫，用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生。结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因。蛋白质印迹法分析结果表明，HA-VN.tPA转染293T细胞后，细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达。ELISA分析结果表明，以HA-VN.tPA免疫3次后，实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体（血清中平台期抗体滴度达1:13 500）。结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA 基因DNA疫苗，该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体。     

前列腺特异性抗原EIA试剂盒的研制及应用

目的 建立可定量测定人血清中前列腺特异性抗原（ＰＳＡ）含量的夹心ＥＬＩＳＡ法,研制ＰＳＡ－ＥＩＡ检测试剂盒。方法 从健康男性精液中提取并纯化ＰＳＡ,分别免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠和山羊制备特异性单克隆抗体和多克隆抗体,并以纯化的ＰＳＡ为标准品,建立可定量测定血清中ＰＳＡ含量的夹心ＥＬＩＳＡ法。在此基础上组装ＰＳＡ－ＥＩＡ试剂盒,对该试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、正确性和稳定性等多项指标进行评价。应用该     

f/t-PSA比值对t-PSA在正常范围内的Pca患者早期诊断的临床意义

目的:研究前列腺特异性抗原游离与总量(f/t-PSA)比值对t-PSA在正常范围内前列腺癌(Pca)早期诊断的价值.方法:采用电化学发光免疫分析技术检测150例正常健康男性,106例t-PSA>4.0μg/L及22例t-PSA<4.0μg/L的Pca患者血清t-PSA和f-PSA并求出f/t-PSA比值,然后进行统计学...     

检测可溶性TREM-1的ELISA法的建立及初步应用

目的:建立定量检测可溶性TREM-1的抗体夹心ELISA法。方法:采用抗人TREM-1单克隆抗体(mAb)包被酶标板,以兔抗鼠TREM-1多克隆抗体为夹心抗体、HRP标记羊抗兔IgG为检测抗体、重组小鼠可溶性TREM-1为标准品,建立检测可溶性TREM-1的ELISA法,并对30例正常人和30例急性肺部感染患者血清样本进行了检测。结果:建立的夹心ELISA法检测TREM-1的线性范围为0.78～200μg/L,批内、批间变异系数分别为6.52%和9.46%。30例正常人和30例血清急性肺部感染患者TREM-1的含量分别为(0.69±0.18)μg/L和(1.16±0.42)μg/L,两者比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论:成功建立了一种灵敏度高、稳定性好的检测可溶性TREM-1的抗体夹心ELISA法。     

超声与血清t-PSA和f-PSA／t—PSA比值对前列腺癌诊断的价值

目的探讨血清总前列腺特异性抗原（t-PSA）、游离前列腺抗原／总前列腺抗原（f-PSA／t-PSA）比值与超声联检对前列腺癌（PCa）的诊断价值。方法将38例经手术和病理证实的PCa患者与45例前列腺增生（BPH）患者和40名正常人的t-PSA、f-PSA／t-PSA比值检测结果进行对比。并和超声联检结果进行分析。结果PCa患者血清t-PSA含量显著高于其它两组,差异有统计学意义（P〈0．01）。t-PSA和f-PSA／t-PSA比值作为单一指标应用于诊断PCa时,灵敏度分别为47．37％、73．68％,准确性分别为51．8l％、71．08％,与超声影像学三者联检,诊断PCa的灵敏度为94．73％,特异性为95．56％,准确性为95．18％。三者联检均高于其单检的敏感性,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论t-PSA、t-PSA／foPSA是诊断PCa的较好指标。血清t-PSA、t-PSA／f—PSA比值和影像学联检可大大提高对PCa的诊断率,对PCa患者早期诊断、早期治疗和监控有重要作用。     

移行带前列腺特异性抗原密度在前列腺特异性抗原4．0-10．0和10．1-20．0μg／L时诊断前列腺癌的作用

目的探讨移行带前列腺特异性抗原密度（TZPSAD）在前列腺特异性抗原（PSA）4．0-10．0μg,L和10．1-20．0μg/L时诊断前列腺癌的意义。方法回顾性分析1999年11月至2009年8月在本院行前列腺穿刺活检的患者资料,以PSA4．0-20．0μg／L且有经直肠B超测量前列腺移行带资料的189例患者为研究对象,用接受者操作特性（ROC）曲线计算评估PSA和TZPSAD诊断前列腺癌的意义。分析PSA和TZPSAD不同临界点在PSA4．0-10．0μg／L和10．1-20．0μg,L范围内对前列腺癌的诊断效力。结果40例（21．2％）诊断为前列腺癌,PSA4．0-10．0μg／L时前列腺癌的阳性率为20．5％（16／78）,PSA10．1-20．0μg／L时前列腺癌的阳性率为21．6％（24／111）,两者差异无统计学意义（P=0．854）。PSA4．0-10．0μg／L时,PSA和TZPSAD预测前列腺癌ROC曲线下面积（AUC）分别为0．569和0．702;PSA10．1-20．0μg／L时,USA和TZPSAD预测前列腺癌AUC分别为0．463和0．730。TZPSAD0．370和0．500ng·ml·ml^-1分别在PSA4．0-10．0和10．1-20．0μL的诊断效力最大,其敏感性分别为68．8％和70．8％,特异性分别为72．6％和70．1％。结论TZPSAD在PSA4．0-10．0和10．1-20．0μg/L时诊断前列腺癌的效力均明显优于PSA,可明显提高PSA诊断前列腺癌的阳性率,减少不必要的前列腺穿刺活检。     

检测人IL 37双抗夹心ELISA方法的建立

目的：建立定量检测人血清IL-37的双抗夹心ELISA。方法：以鼠抗人IL-37单抗作为捕获抗体,制备的兔抗人IL-37多抗作为检测抗体,HRP标记山羊抗兔IgG为二抗,重组人IL-37蛋白为标准品,建立检测人IL-37的双抗夹心ELISA方法。并对该方法的工作条件进行优化,对其灵敏度、线性范围、重复性和对登革热非结构蛋白NS1阳性患者血清IL-37的检测效果进行评价。结果：重组IL-37蛋白为标准品建立的双抗夹心ELISA法检测灵敏度为1.465 μg/L,线性范围为1.465~46.875 μg/L,批内和批间变异系数分别为6.6%和11.7%。采用此方法对诊断为登革热的患者血清进行检测,结果显示非结构蛋白NS1阳性患者IL-37水平显著高于健康人对照组。结论：成功建立了双抗夹心ELISA检测方法,可用于人血清中IL-37的检测。     

结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选

目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10（CFP-10）／早期分泌抗原靶点6（ESAT-6）融合蛋白（CE融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体7肽库进行筛选，经3轮生物淘选后，随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法，选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列，其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr（WDAT）保守序列，该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测，有7个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S／N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示，单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白（分别为0．931±0．298 vs 0．317±0．157、0．496±0．073 vs 0．118±0．026，均P〈0．05）；单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95％，19／20）明显高于CE融合蛋白（60％，12／20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9／10）低于CE融合蛋白（10／10）。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位，提高了ELISA检测的敏感性，为进一步研究CE融合蛋白的?     

Role of Prostate Volume in the Early Detection of Prostate Cancer in a Cohort with Slowly Increasing Prostate Specific Antigen

Purpose

To investigate the relationship between prostate volume and the increased risk for being diagnosed with prostate cancer (PCa) in men with slowly increasing prostate specific antigen (PSA).

Materials and Methods

A cohort of 1035 men who visited our hospital''s health promotion center and were checked for serum PSA levels more than two times between January 2001 and November 2011 were included. Among them, 116 patients had a change in PSA levels from less than 4 ng/mL to more than 4 ng/mL and underwent transrectal ultrasound guided prostate biopsy. Median age was 55.9 years and 26 (22.4%) had PCa. We compared the initial PSA level, the last PSA level, age, prostate volume, PSA density (PSAD), PSA velocity, and follow-up period between men with and without PCa. The mean follow-up period was 83.7 months.

Results

Significant predictive factors for the detection of prostate cancer identified by univariate analysis were prostate volume, follow-up period and PSAD. In the multivariate analysis, prostate volume (p<0.001, odds ratio: 0.890) was the most significant factor for the detection of prostate cancer. In the receiver operator characteristic curve of prostate volume, area under curve was 0.724. At the cut-off value of 28.8 mL for prostate volume, the sensitivity and specificity were 61.1% and 73.1% respectively.

Conclusion

In men with PSA values more than 4 ng/mL during the follow-up period, a small prostate volume was the most important factor in early detection of prostate cancer.     

姜黄素对前列腺癌细胞LNCaP增殖的影响

目的:姜黄素对前列腺癌细胞株LNCap增殖和凋亡的影响。 方法:用不同剂量的姜黄素分别处理LNCap细胞，显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞生长情况；流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡率；然后检测姜黄素处理LNCap细胞后培养液中总前列腺特异抗原（PSA）的变化，并用免疫印迹Western blotting技术检测雄激素受体（AR）的表达。 结果:姜黄素能够抑制前列腺癌细胞LNCap的增殖和生长，40 μmol/L作用24 h最强，细胞存活率为对照的40%；姜黄素诱导LNCap细胞凋亡，细胞形态呈凋亡特征，且40 μmol/L作用最强，凋亡率为9.23%；姜黄素抑制LNCap细胞PSA表达，且40 μmol/L姜黄素处理细胞24 h对PSA表达的抑制作用最强，PSA含量仅为对照的20%；Western blotting检测结果显示姜黄素抑制AR的表达，并且对AR表达的抑制程度依赖于姜黄素的浓度。 结论:姜黄素抑制LNCap细胞增殖，诱导细胞凋亡，且表现出时间和剂量依赖性。姜黄素抑制LNCap细胞PSA与AR 受体的表达。