人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的 在大肠杆菌中表达抗入ＴＮＦ－α单链抗体（ＳｃＦｖ）,并分析它的结合活性和中和活性。方法 在获得抗人ＴＮＦ－αＥＳｃＦｖ基因的基础上,用热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中表达Ｅ６ＳｃＦｖ蛋白。ＥＬＩＳＡ测定抗体的结合活性,实时ＢＩＡ技术确定亲和常数。Ｌ９２９细胞毒试验分析其中和活性。结果 克隆了抗人ＴＮＦ－αＥ６ＳｃＦｖ基因的热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中,经４２℃热诱导,得到了相对分子质     

PGE_2与LTB_4在微管对TNF－α合成调节中的作用

本研究证实完善的微管功能对ＴＮＦ－α的合成是必要的。如用秋水仙碱（Ｃｏｌ）抑制微管聚合，则可减少ＭΦ产生ＴＮＦ－αＣｏｌ对ＴＮＦ－α的抑制作用部分是由于该药引起前列腺素Ｅ＿２（ＰＧＥ＿２）升高所致，因为用环加氧酶抑制剂消炎痛（Ｉｎｄｏｍ，）阻断ＰＧＥ＿２合成，可部分拮抗Ｃｏｌ的这一抑制作用。此外，Ｃｏｌ可抑制花生四烯酸的另一产物白三烯（ＬＴＢ＿４）的产生，然而补充外源性ＬＴＢ＿４并不影响Ｃｏｌ对ＴＮＦ－α的抑制作用。     

家兔EGTA性发热时脑腹中隔区AVP含量的变化

本研究采用新西兰家兔４８只，随机分成４组，分别观察向侧脑室灌注ＥＧＴＡ、ＥＧＴＡ＋ＣａＣｌ＿２或ＣａＣｌ＿２对体温和脑腹中隔区ＡＶＰ含量的影响。结果表明，侧脑室灌注ＥＧＴＡ，不仅引起结肠温度明显上升（Ｐ＜０．００１）．还引起腹中隔区ＡＶＰ含量明显降低（Ｐ＜０．０５）；灌注ＥＧＴＡ后立即灌注ＣａＣｌ＿２，抑制了结肠温度的升高并逆转了腹中隔ＡＶＰ含量的降低。体温反应指数与腹中隔区ＡＶＰ含量呈显著负相关（ｒ＝－０．８３７４，Ｐ＜０．０１）；单独灌注ＣａＣｌ＿２引起结肠温度下降和腹中隔ＡＶＰ含量明显增加（Ｐ＜０．０１），提示ＡＴＰ可能参与ＥＧＴＡ性发热的中枢调节机制，中枢Ｃａ￣（２＋）浓度或Ｎａ￣＋／Ｃａ￣（２＋）比值变化可能是调控发热时腹中隔区ＡＶＰ释放的一个重要因素。     

分泌抗rHuIL—6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究

应用常规方法建立了４株稳定分泌抗重组人ＩＬ－６（ｒＨｕＩＬ－６）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）小鼠杂交瘤细胞系１Ｈ３、２Ａ１０、３Ａ３和４Ｂ１。其中，１Ｈ３为ＩｇＧ２ｂ（Ｋ），２Ａ１０为ＩｇＧ１（Ｋ），３Ａ３和４Ｂ１为ＩｇＧ２ａ（Ｋ）。４株ＭｃＡｂ特异性强，与细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＣＡＭ－１，以及受体菌菌体蛋白成分均无交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水ＭｃＡ     

抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达

目的：构建抗内毒素（ＬＰＳ） 单链抗体基因, 并尝试其在Ｅ．ｃｏｌｉ 中的表达。方法： 采用ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍ ｅｒ Ｍｉｘ ,按ＶＨｌｉｎｋｅｒＶＬ 的结构将鼠抗ＬＰＳ ｍ Ａｂ Ｃ３Ａ２ 的ＶＨ ,ＶＬ 基因拼接成单链抗体（ＳｃＦｖ） 基因;用ＰＥ３７３Ａ 型全自动ＤＮＡ序列分析仪测定其核苷酸序列。ＰＣＲ 扩增抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ ;转染Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ,以ＩＰＴＧ 诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物。结果：扩增出的ＳｃＦｖ基因长７３５ｂｐ , 序列分析表明,该序列完整、正确;ＳＤＳＰＡＧＥ 显示,转染入重组质粒ｐ４ＴＣ３Ａ２Ｆｖ 的ＪＭ１０９ 菌经诱导后,有相对分子质量（ Ｍｒ） 约为５２ ０００ 的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达了ＧＳＴＳｃＦｖ 融合蛋白。     

糖皮质激素受体阻断对大鼠白细胞粘附的作用

目的明确ＧＲ阻断后对白细胞粘附的作用及可能的作用机制。方法１．在体实验。观察肠系膜微循环白细胞贴壁粘附数。 ２．高体实验。（１）ＰＭＮ与玻璃珠粘附;ＰＭＮ粘附率（％）粘附：ＰＭＮ粘附率（％）＝粘附前ＰＭＮ计数一洗脱液ＰＭＮ计数（３）ＰＭＮ粘附 粘附前ＰＭＮ计数分子ＣＤ１８：ＥＬＩＳＩＡ检测;（４）ＣＤ１８表达和ＰＭＮ与ＩＣＡＭ－１包被磁珠粘附的关系：ＰＭＮ与ＩＣＡＭ－１包被磁珠粘附,同时测定ＣＤ１８表达。结果１．在体实验。对照组仅有少量白细胞贴壁粘附（２．５０±２．１７）,阻断ＧＲ后白细胞贴壁粘附±Ｄｅｘ组的粘附率与ＴＮＦ组相比无显著差异（Ｐ＞０．０５）,Ｄｅｘ±ＴＮＦ组的粘附率与ＴＮＦ组相比有下降趋势．但差异不显著。ＴＮＦ＋Ｄｅｘ＋ＲＵ４８６组的粘附率与ＴＮＦ组和对照组相比均有差异（分别是 Ｐ＜０． ０５,Ｐ＜０． ０１）。 ２． ＰＭＮ与 ＥＣ粘附： ＴＮＦ组与ＴＮＦ＋Ｄｅｘ组结果同ＰＭＮ与玻璃珠粘附。Ｄｅｘ＋ＴＮＦ组的粘附率与ＴＮＦ组相比差异显著（Ｐ＜０．０５）。ＴＮＦ＋Ｄｅｘ＋ＲＵ４８６组的粘附率与对照组相差十分显著（Ｐ＜０．０１）,与ＴＮＦ组相比,两者无明显差异。３．ＰＭＮ与ＩＣＡＭ－１包被磁珠粘附：ＴＮＦ     

抗病毒蛋白MxA的诱导和检测方法的实验研究

目的 研究抗病毒蛋白ＭｘＡ的表达及其活性。方法用ＩＦＮα２ｂ或３型腺病毒（Ａ＿３）分别对ＷＩ－３８细胞或人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）作用 １２或２４ ｈ，并用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ法或ＦＡＣＳ法，分别对Ｍ蛋白的表达进行定性和定量检测。采用微量细胞病变抑制法，对重组的ＭｘＡ和ＩＦＮα２ｂ进行抗病毒效应实验。结果 （１）低浓度的 ＩＦＮα２ｂ（＞ １×1０～＃ＩＵ／Ｌ）和Ａｄ＿３（＞２００ ＴＣＩＤ＿５０），均可诱导相应细胞表达 ＭｘＡ；（２）１０μｇ／Ｌ ＭｘＡ可抵抗２０个 ＴＣＩＤ＿（５０）的 ＨＳＶ－Ｉ、Ｐｏｌｉｏ． Ｖ感染 Ｖｅｒｏ细胞、Ａｄ＿３感染ＨｅＬａ细胞，抵抗２００个ＴＣＩＤ＿（５０）的ＶＳＶ感染Ｗｉｓｈ细胞。结论ＭｘＡ只能由干扰素（ＩＮＦα2ｂ）或病毒诱导产生，其具有广谱的抗病毒活性。     

抗Tac单克隆抗体对ConA诱导小鼠实验性肝损伤的影响

本研究采用ＣｏｎＡ诱导，建成小鼠肝损伤模型，并检测其血浆肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）含量的变化，发现模型组鼠血浆ＴＮＦ－α含量为０．１９±０．０６ｎｇ／ｍｌ，而正常对照组未检出ＴＮＦ－α，二者比较有极显著差异（Ｐ＜０．００１）。预先注射抗Ｔａｃ单克隆抗体可减少ＣｏｎＡ注射后小鼠ＴＮＦ－α的产生，与模型组比较（分别为０．０３±０．０２和０．１９±０．０６），二者有极显著差异（Ｐ＜０．００１），而且注射抗Ｔａｃ单抗组无肝损伤发生。上述结果表明，ＣｏｎＡ诱导的肝损伤与ＴＮＦ－α等的介导有关，抗Ｔａｃ单克隆抗体对ＣｏｎＡ诱导的肝损伤有保护作用。     

抗重组人肿瘤坏死因子－α单克隆抗体的研制及其初步应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术获得１０株抗重组人肿瘤坏死因子－α（ｒＨｕＴＮＦ－α）ＭｃＡｂ。７株ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１，２株为ＩｇＧ２ａ，１株为ＩｇＧ２ａ。１０株ＭｃＡｂ与淋巴毒素（ＬＴ或ｒＨｕＴＮＦ－β）、ｒＨｕＩＬ－６和载体菌菌体蛋白均无交叉反应。其中７株ＭｃＡｂ具有中和活性，７株ＭｃＡｂ能识到天然的ＴＮＦ－α。Ｇ１１和Ｅ６ＭｃＡｂ应用ＡＢＣ法免疫组化染色肝病患者组织细胞片得到明确的阳性结果。用２株识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了一步夹心ＥＬＩＳＡ法，检测ＴＮＦ－α的敏感性可达到１００ｐｇ／ｍｌ左右。     

TNF-α单抗Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的进行ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ段基因的克隆并在大肠杆菌中表达。方法用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆重链Ｆｄ段和κ链基因；并用ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析证明表达的Ｆａｂ段特异结合ＴＮＦ－α。结果从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆出了重链Ｆｄ段和κ基因。经ＤＮＡ序列测定表明，ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ３Ｄ、ＤＳＰ２和ＪＨ４；Ｖκ和Ｊκ分别属于Ｖκ１和Ｊκ１。将该Ｆｄ和κ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ中，在大肠杆菌中获得了表达。结论ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析表明，表达的Ｆａｂ段可特异地和ＴＮＦ－α结合。     

细胞因子对心脏微血管内皮细胞与淋巴细胞粘附的影响

目的：观察细胞因子对心脏微血管内皮细胞表面细胞间粘附分子－１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１，ＩＣＡＭ－１）的表达的调控，及对内皮细胞与激活淋巴细胞粘附的影响。方法：体外培养大鼠心脏微血管内皮细胞，以肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α，ＴＮＦ－α）、白细胞介素－６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ－６）和白细胞介素－１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１β，ＩＬ－１β）诱导。采用免疫组织化学染色法观察内皮细胞表面ＩＣＡＭ－１表达；采用粘附试验和抗ＩＣＡＭ－１或抗ＬＦＡ－１单克隆抗体阻断抑制试验。结果：ＴＮＦ－α、ＩＬ－６和ＩＬ－１β诱导内皮细胞１８～２４ｈ，均可使内皮细胞与淋巴细胞的粘附率显著增加，ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β的诱导还可使内皮细胞表面ＩＣＡＭ－１分子表达明显增强，表现为ＩＣＡＭ－１表达阳性细胞数增多，着色加深。用１０～２０ｍｇ／Ｌ抗ＩＣＡＭ－１或抗ＬＦＡ－１单克隆抗体均可部分抑制内皮细胞与淋巴细胞的粘附。结论：ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β可以有效地激活心脏微血管内皮细胞，通过诱导内皮细胞ＩＣＡＭ－１表达增多，促进内皮细胞与淋巴细胞的粘附     

丙型肝炎病毒感染慢性化的分子生物学机制

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染有较高的慢性化比例。ＨＣＶ的核心蛋白对于淋巴毒素β受体（ＬＴ－βＲ）,肿瘤坏死因子α受体（ＴＮＦαＲ）,包膜糖蛋白Ｅ２对Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）,非结构蛋白ＮＳ５Ａ对双链ＲＮＡ结合蛋白ＰＫＲ和干扰素α（ＩＦＮα）诱导的抗病毒蛋白ＭｘＡ等机体免疫系统的调变作用是ＨＣＶ感染慢性化的主要分子生物学机制。     

分泌抗rHuIL－6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究

应用常规方法建立了４株稳定分泌抗重组人ＩＬ－６（ｒＨｕＩＬ－６）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系１Ｈ３、２Ａ１０、３Ａ３和４Ｂ１。其中，１Ｈ３为ＩｇＧ２ｂ（ｋ），２Ａ１０为ＩｇＧ１（ｋ），３Ａ３和４Ｂ１为ＩｇＧ２ａ（ｋ）。４株ＭｃＡｂ特异性强，与细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＣＡＭ－１，以及受体菌菌体蛋白成分均无交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水ＭｃＡｂ效价为１０（－６）～１０（－８）。应用识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＩＬ－６，敏感性为１００ｐｇ／ｍｌ。初步应用表明可用于临床标本的检测。     

肿瘤坏死因子及磷脂酶A2在实验性急性肝衰竭中的作用

应用Ｄ－ＧａｌＮ＋ＥＴ复制急性肝衰竭（ＡＨＦ）动物模型，检测肝衰竭鼠血清中肿瘤坏死的子（ＴＮＦ）含量及肝组织匀浆中磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）活性，探讨二者在ＡＨＦ的作用，结果发现，ＡＨＦ组鼠血清中ＴＮＦ含量及肝组织匀浆中ＰＬＡ２活性明显高于正常对照组（Ｐ〈０．０５，Ｐ〈０．０１），提示ＴＮＦ可能激活ＰＬＡ２后者与ＴＮＦ所致的肝损伤有关。     

登革病毒对人血管内皮细胞产生细胞因子的影响

目的了解登革病毒感染对人血管内皮细胞产生几种细胞因子的影响。方法用登革病毒Ⅱ型（ＤＶ－２）及ＬＰＳ单独作用或联合作用于人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ），于作用后４，２４，４８，７２和９６小时分别收集培养上清液，用ＥＬＩＳＡ法检测ＧＭ－ＣＳＦ，ＩＬ－６和ＴＮＦα的含量。实验数据采用方差分析处理。结果ＤＶ－２感染能使ＨＵＶＥＣ分泌ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的能力增强。病毒感染后４小时，ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的水平开始升高，并分别于感染后７２和２４小时达高峰，然后开始下降。然而，ＤＶ－２感染并不能提高ＨＵＶＥＣ分泌ＴＮＦα的能力。ＬＰＳ单独作用或ＤＶ－２与ＬＰＳ联合作用均可提高ＨＵＶＥＣ分泌ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的能力，但对分泌ＴＮＦα的能力没有明显的促进作用。结论登革病毒感染能提高ＨＵＶＥＣ分泌ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的能力。细胞因子在登革病毒的致病与免疫过程中可能起重要作用。     

抗细菌核心糖脂域McAb对LPS体外诱导细胞释放TNF－α和IL－6及其mRNA表达的影响

用细胞因子活性检测，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法，在体外研究了抗细菌核心糖脂域ＭｃＡｂ（ＥＬ１、ＥＬ３和３Ｈ４）对ＬＰＳ诱导人外周血单核细胞（ｈＰＢＭＣ）释放ＴＮＦ－α和ＩＬ－６及其ｍＲＮＡ表达水平的影响。结果表明，ＥＬ１、ＥＬ３和３Ｈ４在体外有抑制ＬＰＳ诱导细胞释放ＴＮＦ－α和ＩＬ－６的作用；Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，这３株ＭｃＡｂ能分别降低细胞ＴＮＦ－α和ＩＬ－６ｍＲＮＡ表达的水平；提示抗细菌核心糖脂域ＭｃＡｂ可能通过与ＬＰＳ的结合而中和ＬＰＳ，从而降低或阻碍了效应细胞炎性细胞因子ｍＲＮＡ的表达，达到降低相应细胞因子的作用。     

促炎症细胞因子刺激人类关节骨膜Ｂ型细胞表达粘附分子

目的：透析相关性淀粉样变（ＤＲＡ）病人关节滑膜组织粘附分子表达增强,并与局部炎与细胞浸润密切相关。旨在探讨ＤＲＡ时秀导滑膜细胞分子表达上调的机制,方法：分离正常人关节滑膜Ｂ型细胞,与晚期糖基化终产物修饰的β微球蛋白（ＡＧＥ－β２m）、天然β２m、肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）,白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）在体外共同培养,用荧光单克隆抗体染色,流式细胞仪检测定量分析滑膜Ｂ型细胞表面细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）,血管细胞间粘附分子－１（ＶＣＡＭ－１）、Ｅ－选择素（Ｅ－selectin)的表达,结果：正常关节滑膜Ｂ型细胞表达ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１,但不表达Ｅ－selectin.IL-1β、ＴＮＦ－α能以时间和剂量依赖的方式上调滑膜Ｂ型细胞ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１的表达,但无诱导Ｅ－selectin表达的作用。ＡＧＥ－β２m 和β２m对Ｂ型细胞粘附分子的表达无直接影响,结论：ＤＲＡ时关节组织存在的促炎症细胞因子可能上调滑膜细胞粘附分子的表达,从而促使局部的单核细胞浸润。     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因 …

目的 构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β－半乳糖苷酶基因。方法 从人二倍体细胞的Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８．８－８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β－半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲＩ酶切Ａｄ     

腺病毒、合胞病毒对外周血单个核细胞的IL-2受体表达及TNFα产生的影响

近年来国内外均注意到细胞因子及受体与病毒感染的关系。作者用１００ＴＣＩＤ５０的７型腺病毒（ＡＤＶ）及呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｌｏｎｇ株刺激正常人体外培养的外周血淋巴细胞（ＰＢＭＣ），ＡＰＡＡＰ法检测淋巴细胞ＩＬ－２受体阳性率，酶联免疫法检测淋巴细胞上清液的ＴＮＦａ。初步观察了ＡＤＶ、ＲＳＶ对人ＰＢＭＣ的ＩＬ－２受体表达、ＴＮＦα产生的影响。经２００Ｕｇ／ｍｌ的ＰＨＡ活化的ＰＢＭＣ加入ＡＤＶ、ＲＳＶ后对照组ＩＬ－２＋细胞百分率为３４．３％，ＡＤＶ组为１７．３％，ＲＳＶ组为１７％，较对照组均显著降低…     

秋水仙碱对巨噬细胞分泌TNF－α的影响

微管聚合抑制剂秋水仙碱（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ，Ｃｏｌ．）能剂量依赖性地抑制ＬＰＳ刺激的大鼠巨噬细胞（Ｍψ）分泌ＴＮＦ－α。Ｃｏ１的衍生物β－ｌｕｍｉｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ对微管无影响，对ＴＮＦ－α的分泌亦无影响；其他微管抑制剂如长春新碱等亦能抑制Ｍψ分泌ＴＮＦ－α。间接免疫荧光染色和原位杂交法显示，ＬＰＳ能促进微管聚合，并使ＴＮＦ－αｍＲＮＡ及蛋白质表达明显增加；当ＬＰＳ与Ｃｏｌ．联用时，微管解聚，ＴＮＦ－αｍＲＮＡ表达及其蛋白质合成减少，ＴＮＦ－α失去原有的胞浆定位，弥散分布于胞浆。说明ＴＮＦ－α的合成需要完好的微管结构与功能，并提示在生理或病理条件下微管功能的变化可能直接或间接参与对ＴＮＦ－α生物合成的调节。