定量检测ProMBP双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:建立定量检测ProMBP的双抗体夹心ELISA方法.方法:采用Protein A亲和层析法纯化自制的抗ProMBP单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western blot对纯化抗体特性进行鉴定;利用简易过碘酸钠法对抗ProMBP mAb进行标记辣根过氧化物(HRP)后行抗体配对实验;通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度;以纯化的妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)/ProMBP抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收性实验评价ELISA方法,初步对人血清中的ProMBP水平进行检测.结果:最佳配对组合为抗ProMBP mAb 4C6E5B9和HRP标记的抗ProMBP mAb 9G4A6G10,最适工作浓度分别为2.5 μg/ml和1:3 000,该方法的批内、批间变异系数分别为4.6%～6.2%和4.6%～10.5%,灵敏度达2.0 ng/ml,回收率为92%～113%.正常非妊娠血清、9～11周妊娠血清、15～17周妊娠血清ProMBP水平分别为(26.37±2.90)ng/ml、(357.71±33.60)ng/ml和(1088.77±58.13)ng/ml.结论:建立了一种可用于检测ProMBP的双抗体夹心ELISA方法.     

卵清蛋白多克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立卵清蛋白(ovalbumin,OVA)双抗体夹心ELISA检测方法并进行验证,用于定量检测鸡胚流感疫苗中的OVA含量。方法 建立双抗体夹心酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),对该方法的反应条件进行优化,确定定量范围及检测下限,并对重复性、特异性和准确度进行验证。结果 建立的方法最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为2.5μg/ml和0.5μg/ml,最适封闭液配方为1%BSA+1%蔗糖。该方法的cut-off值为0.134,线性范围为0.313-20.000ng/ml,定量下限为0.078ng/ml。重复性好,板内变异系数为3.428%~25.953%,板间变异系数为5.375%~ 27.614%。特异性好,准确度高,检测结果与试剂盒检测结果符合率为91.43%~102.96%。稳定性好,预包被的酶标板冻存于-20℃,半年内检测样本变异系数为1.976%~14.409%。结论 建立了快速、简便、低成本的OVA定量检测方法,可用于鸡胚流感疫苗中OVA定量检测。     

双抗体夹心ELISA定量检测IL-2-HSA融合蛋白

以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2 μg/mL和0.5 μg/mL,方法的线性检测范围39.06~1250 ng/mL,标准曲线回归方程为y=0.442 9 x-1.143 3,r=0.996 6,灵敏度可达10.25 ng/mL,批内、批间变异系数分别为6.40%和7.81%,发酵上清液中回收率为98.13%~102.94 %,与IL-2、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清组分及稀释倍数对该方法无影响。该方法可用于该融合蛋白的发酵过程优化、分离纯化工艺、后期药动学、临床研究等的定量检测。     

双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶抗体

目的：建立检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase GliT,TR）特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,同时对其临床应用进行评价。方法：利用基因工程技术制备重组TR作为包被抗原和酶标记抗原,采用棋盘滴定法优化双抗原夹心ELISA法的反应条件,并考察ELISA法的敏感性、特异性以及重复性。用双抗原夹心ELISA法测定273例住院患者（侵袭性曲霉病50例、侵袭性念珠菌病46例、念珠菌定植82例、细菌感染95例）以及200例健康人血清,并与实验室前期建立的间接ELISA法检测TR抗体的结果进行比较。结果：双抗原夹心ELISA法工作条件为TR抗原包被浓度为1.0 μg/mL,酶标抗原1∶500稀释;封闭液含50 g/L脱脂奶粉溶液的PBS?T,待测血清稀释度为1∶100。患者血清检测结果显示,高、中、低3份血清批内变异系数（CV）分别为11.2%、11.8%和12.3%;不同批次重复测定6次,其批间CV分别为10.9%、12.1%和13.5%。重组抗原对血清中相应抗体的阻断率为94.4%。通过ROC曲线确定吸光度的cut?off值为0.126。检测侵袭性曲霉病的敏感性和特异性分别为80.0%（40/50）和95.5%（404/423）,敏感性高于检测TR抗体的间接ELISA法（83.3% vs. 72.2%）。结论：建立了双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉TR特异性抗体,可提高侵袭性曲霉病的诊断率,具有临床应用价值。     

双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立及临床应用

目的　建立检测肺炎支原体抗原的双抗体夹心ELISA ,探讨其临床应用的可行性。方法　采用不同株Mp单抗 ,用双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原 ,优化该方法检测Mp抗原的最佳实验条件。对Mp标准株及 14 7份临床标本进行测定 ,观察双抗体夹心ELISA方法的敏感度和特异度 ,以及该方法与聚合酶链反应 (PCR)检测法的符合率。结果　包被单抗量为 2 0 μg·ml-1,酶标记单抗 1∶2 0 0稀释时 ,阳性对照与阴性对照吸光度之比 (P/N值 )最大 ;检测Mp抗原敏感度达 2 μg·ml-1,和其它支原体没有交叉反应。 14 7份临床标本PCR检测阳性率为 13 .6% (2 0 /14 7) ;双抗体夹心ELISA法检测阳性率为 12 .2 % (18/14 7) ,两者符合率达 95 .9%。结论　建立的双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。     

双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的初步建立

目的 建立快速检测骨唾液酸蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,为试剂盒的研制奠定基础。方法 用鼠抗人骨唾液酸蛋白（BSP）单克隆抗体包被酶标板,兔抗人BSP检测,辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗与兔抗人BSP相结合,初步建立BSP的双抗夹心ELISA检测方法。结果 自建双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的灵敏度为1.5ng/ml,标准曲线的线性范围为2-100ng/ml,回归方程y=0.2548x+0.0775 (r=0.992);批内批间变异系数分别为4.6％-5.4％和5.2％-7.1％,对人血清做50、25和10ng/ml三个加标浓度的回收率实验,回收率在47.2％-101％之间;4℃有效期至少360天。结论：成功建立双抗夹心ELISA检测BSP的方法。     

尿液水通道蛋白—2双抗体夹心ELSA测定法的建立

目的：建立较为稳定的定量检尿液水通道蛋白－2（AQP2）的酶联免疫吸附测定（ELISA）法。方法：人工合成AQP2蛋白C－末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段，并与KLH联接，制备兔抗AQP2多肽片段的多克隆抗体，用辣根过氧化物酶标记部分抗AQP2 抗体IgG。建立检测充血性心力衰竭模型大鼠尿液AQP2 的双抗体夹心ELISA法。结果；双抗体夹心ELISA法成功建立，灵敏度为15．625pmol/ml ，批内及批间变异系数分别为4．65％和14．05％；用该法定量检测左冠状动脉结扎术后不同梗死面积充血性心力衰模型大鼠的尿AQP2浓度，其结果与Western blotting半定量检测结果一致。结论：双抗体夹心ELISA法可以较好地定量检测充血性心力衰竭模型大鼠的尿AQP2蛋白浓度，且较Western blotting更加简便易行，便于临床推广使用。     

检测血清ATG浓度ELISA方法的建立

目的建立检测人血清中兔抗人胸腺免疫球蛋白(ATG)的检查方法并进行初步临床应用。方法用鼠抗兔IgG单克隆抗体做固相,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG多克隆抗体做二抗,建立双抗体夹心ELISA方法。并检测使用ATG的异基因造血干细胞移植患者血中ATG的浓度。结果ATG浓度最低检测值为31.25ng/ml,在40～1000ng/ml范围内呈线性关系,组内和组间的变异系数分别为7.91%和5.22%。用该法测定7例干细胞移植预处理方案中使用ATG患者的浓度,ATG随时间在体内浓度逐渐下降,但预处理后90天仍能测得ATG,表明ATG在体内作用时间比较久,可能会影响移植后免疫功能重建。结论双抗体夹心法具有灵敏性高、特异性强的特点,可用于人血清中ATG水平的定量测定。干细胞移植预处理方案中使用ATG后体内浓度进行性降低,ATG将会比较长时间在体内起作用。     

应用双抗原夹心ELISA法筛查献血员梅毒螺旋体抗体

目的：优选一种适宜于献血员梅毒筛查的试验方法。方法：采用检测梅毒特异性抗体的双抗原夹心ELISA法对献血员进行抗体检测，并与RPR检测结果进行比较，对两种方法检测结果不一致的标本，再用TPHA法进行确证。结果：ELISA法阳性检出率0．36％(4l，11271)、RPR法阳性检出率0．26％(29／11271)。ELISA法与TPHA法总符合率97．56％(40／41)、RPR法与TPHA总符合率63．41％(26／41)。结论：ELISA法优于RPR法，具有较高的灵敏度和特异性，适宜于献血员的筛查，有利于控制和减少梅毒的输血传播。     

两种方法检测肺癌患者CAP43蛋白的结果比较

目的 探讨肺癌患者血清和肿瘤组织中Cap43蛋白的表达水平与肺癌不同组织学分型间的关系。方法 通过建立双抗体夹心ELISA法初步定性和定量检测91肺癌患者与正常人群血清中Cap43蛋白含量，并采用免疫组化S-P方法检测83例肺癌术后病例的肿瘤组织切片中Cap43蛋白表达程度。结果 初步建立的双抗ELISA血清学检测方法中确定的包被羊抗人NDRG1多克隆抗体，Ⅰ抗兔抗人Cap43多克隆抗体，辣根酶（HRP）标记的羊抗兔Ⅱ抗的最佳工作浓度分别为1：750，1：1200，1：350，标准蛋白曲线的回归方程为：y=0.53566＋0．00046x，R2=0．9939，P〈0．0001。应用该方法初步检测结果提示肺癌患者血清腺癌组Cap43含量明显高于鳞癌组（P〈0．05），同时免疫组化检测结果也提示肺腺癌组的Cap43表达程度比鳞癌组高（P〈0．05）。结论 肺癌患者血清中以及肿瘤组织Cap43的表达程度与其肿瘤的组织学类型密切相关。     

血清精子蛋白17检测的双抗夹心ELISA法及在卵巢癌诊断中的应用

目的:建立双抗夹心ELISA法检测血清中精子蛋白17(sperm protein 17, Sp17)水平.方法:以重组Sp17蛋白为免疫原制备兔抗Sp17抗体,建立Sp17双抗夹心ELISA检测方法,鉴定其最小检出限、精确度、回收率,并检测42例正常人及28例卵巢癌患者血清Sp17水平.结果:该双抗夹心ELISA法敏感度高、特异性强、重复性好.卵巢癌患者与正常人血清Sp17含量有显著差别(P＜0.01),正常人血清中存在少量Sp17蛋白,而卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高者占39.3%.结论:卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高.测定血清Sp17水平的ELISA方法学确立为阐明Sp17在卵巢癌患者中的免疫生物学意义提供了实验手段.     

重组人源细胞珠蛋白单抗制备及检测方法建立

目的 制备重组人源细胞珠蛋白(recombinant human Cytoglobin,rhCygb)单克隆抗体,并建立检测该蛋白双抗体夹心ELISA法,为下一步研究rhCygb药代动力学做准备.方法 用纯化的rhCygb免疫BALB/c小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法获得抗rhCygb的单克隆抗体杂交瘤细胞,间接E...     

检测水痘-带状疱疹病毒糖蛋白水平双抗体夹心ELISA法的建立和验证

建立可快速检测水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白抗原水平的双抗体夹心ELISA法,并验证其特异性、线性、准确性和精密性。     

双抗体间接夹心ELISA法检测血清MUC1蛋白方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

目的:建立双抗体间接夹心酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒,检测血清黏蛋
白1（MUC1）水平,探讨其在肺癌诊断中的应用,阐明血清MUC1蛋白检测的临床应用
价值。方法:在前期制备的MUC1蛋白和兔抗人MUC1多克隆抗体的基础上,建立以鼠抗人MUC1
单克隆抗体为包被抗体,兔抗人MUC1多克隆抗体为检测抗体的双抗体间接夹心ELISA方法,
并通过对MUC1蛋白标准品的检测,绘制出标准曲线。临床上收集48例肺癌患者、7例肺良性
疾病患者和20例健康人的血清,应用本研究建立的ELISA方法检测各组标本血清MUC1蛋白表
达水平,绘制ROC曲线,确定最佳cut-off值,得出双抗体间接夹心ELISA方法检测肺癌的敏
感度、特异度及约登指数。同时与临床应用的CA15-3试剂盒检测结果进行比较。结果:应用双抗体间接夹心ELISA法确定血清MUC1的临界值为1.98 μg?L-1,检测
肺癌的敏感度为62.5%,特异度为100%,约登指数为0.625　0。CA15-3试剂盒检测肺癌的敏感度
为18.75%,特异度为100%,约登指数为0.187 5。结论:建立的双抗体间接夹心ELISA
试剂盒检测肺癌有更高的敏感度和特异度,优于临床常用的CA15-3试剂盒。     

镍接触工人肺癌与矽肺患者血清中Cap43的表达情况

目的探讨钙激活蛋白(Cap43)在镍接触肺腺癌患者和矽肺患者血清中的表达情况及其表达与镍接触之间的关系。方法采用双抗体夹心ELISA法检测5例镍接触肺腺癌患者血清、20例镍接触矽肺患者血清、23例镍接触工人血清、10例正常人群血清中Cap43的表达。结果血清中Cap43的表达情况:镍接触工人肺腺癌组(n=5)为(1.988±0.048)ng/ml;镍接触矽肺患者组(n=20)为(0.886±0.391)ng/ml;镍接触工人组(n=23)为(0.580±0.119)ng/ml;正常人群对照组(n=10)为(0.260±0.086)ng/ml。结论Cap43表达量随正常人群组→镍接触工人组→镍接触矽肺组→镍接触肺腺癌组走势呈上升趋势,且各组之间Cap43表达差异均有统计学意义。     

B型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用2

目的 制备和鉴定B型流感病毒核衣壳（N）蛋白单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心捕获抗原ELISA,用于B型流感病毒感染的早期诊断。方法 用重组B型流感病毒N蛋白和B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,采用ELISA间接法、免疫荧光（IFA）和免疫印迹（WB）进行筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验建立双抗体夹心捕获抗原ELISA法检测B型流感病毒 N抗原。结果 获得12株特异性针对B型流感病毒 N蛋白的mAb,识别8个不同的抗原位点,根据mAb识别抗原表位,对mAb进行多种组合的配对试验,筛选出2株单抗BN4和BN8混合作为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗BN1 和BN5混合作为测定抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,测定新鲜的漱口液标本的灵敏度达100％,而对冻融的漱口液标本检测灵敏度为83.9％,与其他呼吸道病毒如A型流感病毒、副流感病毒等无交叉反应,特异度达100％。结论 获得特异性好的mAb,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的B型流感病毒抗原的ELISA捕捉法,可用于B型流感病毒感染的早期实验室诊断及流行病学研究。     

Clinical studies on bladder tumor-associated antigen in serum of patients with bladder cancer by using monoclonal antibody and sandwich ELISA

Investigations on tumor-associated antigen in the serum of patients with bladder cancer by using monoclonal antibody Hb 7A and sandwich ELISA were carried out on 36 patients with bladder cancer (BCa group), 18 patients with other tissue tumor (OTT group) and 22 normal subjects (control group). The average OD value of Hb 7A antigen of BCa group, OTT group and control group was 0.315±0.033, 0.124±0.026 and 0.12±0.021 respectively. The OD value of Hb 7A antigen in BCa group was significantly higher than that of control group and of OTT group (P< 0.01), but there was no obvious difference between the control group and OTT group (P> 0.05). The positive detection rate in BCa group was 86% (31/36,), while detection in all 22 normal subjects and the 18 patients of OTT group yielded negative results. The results indicated that the method of using McAb Hb 7A and sandwich ELISA, characterized by high specificity and sensitivity, is of value for clinical diagnosis and follow-up of patients with bladder cancer and general survey of persons at high risk of bladder cancer.     

SPA-ELISA检测棕果蝠血清冠状病毒抗体的研究

目的 建立一种敏感、简便的检测蝙蝠血清冠状病毒抗体的方法.方法 利用葡萄球菌A蛋白(SPA)能够与某些哺乳动物IgG抗体Fc段非特异性结合的特点,对市售人冠状病毒抗体ELISA试剂盒进行改造,建立SPA-ELISA法,使其适用于蝙蝠血清冠状病毒抗体的检测,并对采集到的55份棕果蝠血清冠状病毒抗体进行检测.结果 用SPA-ELISA方法对人冠状病毒试剂盒中阳性与阴性对照、SARS病人恢复期血清、空白对照的检测都得到理想的结果,并从55份棕果蝠血清中检测出2例阳性,阳性率为3.64％(2/55),中和试验进一步证实了结果的真实性.结论 所建立的方式适用于检测棕果蝠血清冠状病毒抗体.