福建省HIV-1新型独特重组毒株的鉴定分析

目的了解福建省1型艾滋病病毒(HIV-1)新型重组毒株的出现和传播情况,为艾滋病防治提供有针对性的科学依据。方法对2015年福建省HIV-1分子流行病学调查发现的未明确分型样本进行流行病学特征分析,分三段nested-聚合酶链反应扩增,获得HIV-1近全长基因片段序列。利用MEGA构建系统进化树,Simplot进行重组断点分析,最后通过Recombinant Drawing工具绘制重组镶嵌模式图。结果福建省56份未明确分型样本主要来自沿海经济较发达地区,且集中在文化程度较低的青壮年男性人群,主要以性传播为主。亚型分析显示,其中38份为CRF01-AE/CRF07-BC混合亚型,9份为01B/01-AE/07-BC混合亚型,9份为CRF55-01B/CRF07-BC混合亚型。对3株HIV-1近全长基因序列进行重组分析显示:XM03025是以CRF07-BC为骨架,在1916-2186bp、2786-5526bp、8726-8776bp、9216-9366bp处分别插入4个CRF01-AE的片段;XM03050是以CRF07-BC为骨架,在4916-6256bp处插入1个CRF01-AE片段;而XM06004是以CRF01-AE为骨架,在6490-6680bp、6920-8290bp、8950-9190bp处分别插入3个CRF07-BC片段。经鉴定该三株为新的独特重组型毒株。结论福建省已出现新的独特型重组毒株,并有可能在局部传播流行;应密切监测其流行趋势变化,并积极采取精准干预加以防控。     

云南省临沧市2012年HIV-1基因型和耐药传播警戒线调查

目的了解2012年临沧市未经抗病毒治疗的艾滋病病毒I型（HIV1）感染者中,病毒的基因型分布和耐药株传播水平。方法根据HIV-1耐药警戒线调查实施方案,对2012年2—7月,临沧市符合方案要求的50份年龄在18—25岁的、新发现的HIV-1感染者的血浆样本,进行耐药基因型检测和耐药株传播水平分析。结果50份血浆样本中,36份完成了基因型及耐药鉴定。通过进化分析对pol区进行分型,75．0％（27／36）的样本为CRF08-BC,其他依次为URF—BC（8．3％,3／36）、CRF07-BC（5．6％,2／36）、CRF01-AE（5．6％,2／36）和c亚型（5．6％,2／36LURF—BC重组中有两例重组模式相同。获得的序列中未检测到监测相关的耐药突变（Surveillancedrugresistancemutations,SDRM）,按照耐药警戒线的统计方法估算,耐药株流行率〈5％。结论临沧市目前主要流行的HIV-1亚型为CRF08-BC,HIV-1耐药株处于低度流行水平。为控制耐药传播水平的上升,在加强重点人群艾滋病防治的基础上,应加强规范艾滋病抗病毒治疗及科学管理,同时有计划地开展相关的耐药监测。     

浦东新区MSM HIV-1分子流行病学的研究

目的了解上海市浦东新区近年来男男性行为人群(MSM)中,未经抗病毒治疗的艾滋病病毒1型(HIV-1)抗体阳性者,其HIV-1亚型分布和原发性耐药特征,监测该地区MSM HIV-1毒株的最新流行情况,为当前该区制定艾滋病防治策略提供科学依据。方法选取2011年至2014年4月份期间确认的MSM HIV-1感染者血浆标本70份,应用巢式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增pol基因,并对扩增产物进行测序,用Mega 6.0软件将测序结果与各亚型国际参考株比对,根据系统进化树分析确定基因亚型及其特征以及耐药情况。结果获62份pol区基因全序列片段,得到CRF01-AE、CRF07_BC、01B(CRF01_AE与B重组亚型)和B四种亚型。分布显示:CRF01-AE占58.06%(36/62),CRF07_BC占30.65%(19/62),01B占6.45%(4/62),B占4.84%(3/62)。离散率显示:CRF01-AE亚型的平均离散率为(2.1±0.2)%(n=36),CRF07-BC亚型的平均离散率也为(2.1±0.2)%(n=19),B亚型的平均离散率为(5.7±0.6)%(n=3),01B重组亚型的平均离散率为(6.3±.0.6)%(n=4)。耐药特征:62例中有7例分别产生了对核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)及蛋白酶类抑制剂(PIs)的耐药突变,其中2例产生了低度耐药,4例具有潜在的耐药特点。结论上海市浦东新区2011年至2014年4月间,MSM新确证HIV-1感染者中,基因亚型呈多元化趋势,以CRF01-AE和CRF07-BC为主,并已形成了浦东新区范围内的局部流行趋势,新的01B重组毒株已在浦东新区开始出现;HIV-1原发耐药株的传播尚处于低度流行水平,密切监视其流行趋势已显十分必要。     

重庆市医疗机构HIV-1感染者/AIDS病人HIV-1遗传分化和耐药突变研究

目的调查重庆市医疗机构中艾滋病病毒(HIV)1型(HIV-1)感染者/艾滋病(AIDS)病人中的HIV-1基因亚型、群体动力学及耐药性。方法收集2013年12月至2016年4月重庆多家医疗机构HIV-1感染者/AIDS病人血浆,通过提取核糖核酸(RNA)、反转录、巢式聚合酶链式反应(PCR),系统发育学和群体遗传学的方法,扩增及分析HIV基因组pol区序列,并检测耐药相关突变。结果共收集657份HIV-1感染者/AIDS病人静脉血样本,扩增及测序得到256份有效的pol基因片段,HIV基因亚型分析显示,重庆医疗机构中流行的HIV-1毒株以CRF07_BC(43.8%,112份)、CRF01_AE(34.8%,89份)为主要基因型;随后依次为CRF08_BC(8.2%,21份)、B(3.5%,9份)、CRF55_01B(2.7%,7份)、CRF68_01B(0.4%,1份)和CRF86_BC(0.4%,1份)。检出耐药基因突变者94例(占36.7%),无耐药基因突变者162例(占63.3%)。不同基因亚型间,pol基因蛋白酶区和反转录酶区的基因突变位点差异无统计学意义(P0.05)。对优势群体CRF07_BC、CRF01_AE和CRF08_BC的群体遗传学分析,证实重庆市医疗机构中的HIV-1部分基因型群体正在经历扩张。结论重庆市医疗机构中HIV-1病毒基因突变和重组普遍存在。HIV-1CRF07_BC、CRF01_AE和CRF08_BC基因亚型正在经历缓慢扩张的过程。需持续研究和监控重庆地区HIV-1在感染者中的遗传分化及耐药进展。     

CRF01_AE CRF07_BC和B''''亚型HIV-1 pol基因及耐药特征分析

目的 研究中国部分地区新发现未经抗病毒治疗的艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者的耐药情况,及不同亚型毒株pol基因的多态性对耐药突变产生的影响.方法 选取2005-2006年湖南、云南、四川和新疆4省(自治区,下同)当年确认的部分样本,进行核酸扩增及测序,利用系统进化及重组分析的方法确定亚型;根据美国斯坦福大学HIV-1耐药数据库,分析不同亚型毒株蛋白酶基因和逆转录酶基因的多态性和耐药突变情况;利用荷兰乌得勒支大学Vijver等人使用的一种遗传障碍定量方法,计算并比较不同亚型间耐药突变产生的遗传障碍.结果 共得到84份样本PR基因区(1-99氨基酸)和RT基因区(1-272氨基酸)的序列,亚型分析显示:84份样本中B'亚型13份,01AE重组亚型27份,07BC重组亚型44份,其中18份样本在蛋白酶基因区的第10位和第71位存在次要耐药突变;来自云南省和湖南省的3份样本中,存在逆转录酶抑制剂相关耐药突变,分别是A62V、V179D和G190A.三种亚型在逆转录酶基因区的2个非核苷类抑制剂相关耐药突变位点V106M和V108I的遗传障碍存在差异,有显著的统计学意义(P＜0.001).结论 4个地区未冶疗感染者中耐药发生的水平较低.遗传障碍的比较,CRF01AE、CRF07BC与B'亚型病人经治疗后主要耐药突变的发展模式应基本一致.     

桂北地区HIV-1感染者HIV-1病毒亚型分布观察

目的观察桂北地区HIV感染者HIV-1病毒亚型分布。方法采集桂北地区80例HIV-1感染者的静脉血,提取其中单个核细胞的DNA,用巢氏PCR扩增病毒膜蛋白env基因的C2-V3区,对PCR纯化产物进行测序,并应用GCG软件等对序列进行分析。结果通过PCR扩增得到env基因序列55份,分属4个亚型,分别为B型1份,CRF07-BC型19份,CRF08-BC型23份,CRF01-AE型8份,C型4份。感染途径为静脉吸毒者16例,性34例,非法献血2例,不详3例。16例吸毒感染者中CRF08-BC型12例,CRF07-BC型4例。34例性行为感染者中CRF07-BC型19例,CRF08-BC型11例,CRF01-AE型4例。结论桂北地区HIV感染者存在HIV-1亚型多样。静脉吸毒感染者以CRF08-BC型为主。性行为感染者以CRF07-BC型和CRF08-BC型为主。     

HIV-1整合酶耐药基因型检测方法的建立

目的随着整合酶抑制剂的使用,整合酶抑制剂耐药突变出现不可避免,为了更好地预防和控制艾滋病,根据中国1型艾滋病病毒(HIV-1)主要流行株建立HIV-1整合酶基因型耐药检测方法。方法根据国内HIV主要流行株(CRF01_AE、B、CRF07_BC、CRF08_BC、C)参考序列,用Oligo软件在整合酶保守区设计引物。挑选160例不同病毒亚型、病毒载量 1 000拷贝/mL的样本,进行巢式荧光定量聚合酶链反应核酸扩增和测序。拼接后的序列输入斯坦福大学耐药网站,进行耐药突变位点分析。结果成功扩增出HIV-1整合酶全长(288个氨基酸),160个样品157个扩增成功(成功率为98.1%)。3名操作人员对15个样本进行扩增和测序,核苷酸序列一致性为(99.83±0.05)%。结论根据中国HIV-1主要流行株建立了整合酶耐药基因型检测方法,有助于优化艾滋病病人抗病毒治疗,有助于HIV-1的防控。     

广西一株HIV-1 CRF01＿AE/CRF07＿BC独特重组毒株的鉴定

目的对一条不能明确亚型的HIV-1近似全长基因组序列进行分析,确定毒株的重组特征及可能来源。方法利用近末端稀释法分两段进行HIV-1近似全长基因组的扩增,获取序列后使用SimPlot软件分析近似全长基因组序列的重组模式及断点,采用分片段构建ML进化树的方法确认重组断点准确性,绘制重组病毒的基因镶嵌模式图。对各基因片段与相应亚型的全部近似全长基因组序列构建ML进化树,推测其亲本毒株可能来源。结果扩增及测序后,获得一条长度为8 943 bp(HXB2:649～9 599)的HIV-1近似全长基因组序列。断点分析表明,该序列的重组模式是以CRF01_AE为骨架插入CRF07_BC片段,其中片段Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ来自CRF01_AE毒株,片段Ⅱ和Ⅳ来自CRF07_BC毒株,4个重组断点相对应于HXB2的位置分别为3 957、4 224、5 560和5 899。亲本毒株来源分析表明,与片段Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ成簇的CRF01_AE序列主要来自东南亚国家如泰国、老挝、越南。片段Ⅱ和Ⅳ则与我国西南地区吸毒人群中的CRF07_BC序列聚集。结论获得一株由CRF01_AE和CRF07_BC重组形成的HIV-1独特重组毒株,其亲本病毒中的CRF01_AE可能与东南亚国家的毒株同源,而CRF07_BC可能来自我国西南地区的吸毒人群。     

贵州省2009年HIV耐药警戒线调查

目的监测贵州省未治疗的HIV感染人群中HIV耐药毒株的传播情况、特点和趋势,为指导抗病毒治疗工作,评价治疗效果,合理调整治疗方案和制订相应应对措施提供依据。方法根据世界卫生组织(WHO)推荐的资源最小化的艾滋病病毒(HIV)警戒线调查方法(HIVDR-TS),对47例艾滋病阳性血清样本用In-house方法,对pol基因区进行了扩增测序,检测耐药传播相关的耐药突变,并分析其相关的亚型及其比例。结果 47例样本中未发现耐药传播相关的突变位点,pol区基因型分析结果显示,47例样本中CRF01_AE亚型占40.4%(19/47),CRF07_BC亚型占29.8%(14/47),CRF08_BC亚型占27.7%(13/47)、C亚型占2.1%(1/47),未发现其他亚型。结论贵州省耐药株流行率<5%,属HIV耐药株的低度流行水平区,其中CRF01_AE亚型所占比例较大。     

天津市HIV/AIDS病人未治疗人群pol基因多态性及耐药性分析

目的了解天津市艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)病人(简称HIV/AIDS病人)未治疗人群中,耐药基因的变异情况,比较不同基因亚型之间pol基因多态性耐药突变的分布差异。方法收集2010年天津市HIV/AIDS病人未治疗人群的血液样本,提取样本DNA,用巢式聚合酶链式反应扩增病毒pol基因,并进行亚型及耐药基因型分析。结果在79例样品中,扩增并得到有效pol基因序列的共有51例,共发现3种基因亚型。其中CRF01_AE为主要亚型,占49.02%(25/51);其次是B亚型,占41.18%(21/51)。检出耐药者8例,占15.69%(8/51),分别为低度和潜在低度耐药。耐药相关突变位点为K103R、V106I、V106IV、E138G、V179E和V179DINV。不同HIV-1基因亚型中,pol基因蛋白酶区和反转录酶区的基因突变差异较大。结论天津市HIV/AIDS病人未治疗人群中,存在一定程度的耐药问题,应加强对HIV-1耐药情况的监测,及时调整防治策略。     

HIV type 1 BF recombinant strains exhibit different pol gene mosaic patterns: descriptive analysis from 284 patients under treatment failure

Different complex structures of the pol gene have been identified in 284 HIV-1 B/F recombinant sequences obtained from a group of 587 patients under treatment failure from Argentina. To analyze the mosaic structures of these viral sequences and to determine their phylogenetic relationship, the 284 partial pol gene sequences of BF recombinant viruses were amplified by RT-PCR and sequenced. Intersubtype breakpoints were analyzed by bootscanning. Phylogenetic relationships were determined by means of neighbor-joining trees. The analysis of the sequences showed multiple phylogenetic topologies clustering within intersubtype BF reference sequences. At least three different mosaic patterns were found compared to previously described BF-type viruses with unequal distribution in the studied population. The analysis also showed that HIV-1 BF recombinant viruses with diverse mosaic structures are phylogenetically related in their F segments and in selected B fragments with the F1 subtype and with BF recombinant viruses from Brazil, respectively, suggesting a common recombinant ancestor. No association was observed between the prevalence of each mosaic pattern and the frequency of major drug-resistance mutations in PR and RT.     

2008-2013年福建省HIV-1毒株耐药基因变异研究

目的 分析2008-2013年福建HIV-1毒株耐药基因变异情况。方法 收集2008-2013年福建省病毒载量大于1 000 copy/mL艾滋病患者,采用自建HIV-1基因型耐药检测进行耐药检测和分析。结果 共收集226例病毒载量大于1 000 copy/mL样本,平均载量值1.62×10⁵copy/mL;124例样本扩增及测序后获得蛋白酶以及部分反转录酶基因序列,亚型分析显示92例(74.2%)为CRF_01AE亚型,14例(11.3%)为B亚型,C和BC亚型各有7例,另4例为其他亚型。77对反转录酶以及蛋白酶抑制剂有不同程度耐药;对核苷类和非核苷类反转录酶抑制剂的耐药分别有63例(50.8%)和74例(59.7%),对蛋白酶抑制剂耐药9例(7.3%);核苷类反转录酶抑制剂主要耐药突变包括了M184V、M41L、D67N、L70R、T219F、K219Q等,造成对3TC、AZT、D4T等不同程度耐药;非核苷类反转录酶抑制主要耐药突变包括K101E、Y181C、K103N、G190A等,造成对NVP和EFV不同程度耐药。结论 福建省HIV-1感染者总体耐药率较低,但是随着治疗人数增加以及治疗时间延长,对反转录酶抑制剂出现较高程度耐药,仍需加强艾滋病患者耐药检测。     

武汉市HIV-1相关基因序列分析及亚型分布

目的研究武汉市HIV感染人群中的HIV毒株的亚型分布特点和流行规律。方法采集武汉市60名已被确认为HIV-1感染者的抗凝全血样品,提取前病毒DNA,用巢式聚合酶链反应方法（nested-PCR）扩增病毒膜蛋白env基因的C2-V5区及gag基因的部分区段,对PCR纯化产物直接测序,并应用GCG软件对序列进行分析。结果通过PCR扩增得到60份样品的结果,其中env基因序列45份、gag基因序列52份。依据env和gag区基因序列,与HIV-1各个亚型国际参考株比较,通过系统进化分析,最后确定武汉市样品分属5个亚型,分别为HIV-1B亚型中的泰国B（B’）亚型32份,流行重组型CRF07-BC12份,流行重组型CRF01-AE9份,A亚型1份和C亚型6份。结论武汉市存在多种HIV-1亚型,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略。     

New HIV type 1 CRF01_AE/B recombinants displaying unique distribution of breakpoints from incident infections among injecting drug users in Thailand

The goals of this study were to identify and characterize recombinant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) genomes among incident infections in a prospective cohort study of injecting drug users (IDUs) in Bangkok, Thailand. Through cross-sectional, comparative phylogenetic analysis of the protease and env (C2-V4) gene regions, subtype discordance was observed in HIV-1 sequences from 4 of 111 IDUs (3.5%). Near-full-length HIV-1 genome sequences of the four strains revealed that in all four, the gp120 sequences clustered with a CRF01_AE prototype, while the remainder of the genomes displayed distinct mosaic patterns, with multiple breakpoints between HIV-1 CRF01_AE and subtype B-like regions. Two of the four HIV-1 recombinant strains displayed a nearly identical mosaic structure, suggesting the possible emergence and spread of a potentially new circulating recombinant form of HIV-1. Further characterization of these and other recombinant genomes through long-term follow-up will be important in understanding the generation of viral diversity and escape from the hosts immune responses. This information will be especially important for vaccine development.     

人类免疫缺陷病毒-1 Vif蛋白的表达及生物学功能

目的 分析上海HIV-1分离株病毒感染因子(Vif)蛋白编码基因突变特点,构建HIV-1vif基因原核表达质粒,并了解其免疫原性.方法 采用RT-PCR法扩增23例上海HIV-1分离株vif基因并测序,与HIV-1国际标准毒株比较;将vif编码基因克隆入原核表达载体pET32b(+),构建pET32b(+)-HIV-1/Vif重组质粒;将该质粒转化入细胞BL21D3(Star)表达,并纯化HIV-1 Vif蛋白,制备Vif蛋白鼠多克隆抗体,并以ELISA检测Vif蛋白及其鼠多克隆抗体的免疫原性.统计学处理采用t检验.结果 上海HIV-1分离株vif基因与国际标准毒株相比较,核苷酸突变率为(0.179±0.006)%,并具有多处相似的变异位点,上海HIV-1分离株Vif蛋白第151～240位氨基酸相对保守;成功构建HIV-1 vif基因原核表达质粒pET32b(+)-HIV-1/Vif,表达并纯化Vif蛋白,制备了Vif多克隆抗体;重组HIV-1 Vif蛋白与HIV感染者及健康人血清反应比较,差异无统计学意义(P＞0.05);鼠多克隆抗体与重组Vif蛋白反应与健康对照组血清比较差异有统计学意义(t=178.61,P<0.01).结论 上海HIV-1分离株vif基因与HIV-1国际标准毒株比较存在较高突变,成功地构建了HIV-1 vif基因原核表达载体pET32b(+)-HIV-1/Vif,制备了Vif多克隆抗体.     

福建省艾滋病患者抗病毒疗效和耐药性检测分析

目的了解我省艾滋病患者的抗病毒疗效与基因耐药性突变发生情况,为抗病毒治疗提供依据。方法采集我省25例接受抗病毒治疗的艾滋病患者外周静脉抗凝全血进行CD4+T淋巴细胞计数,分离血浆进行HIV病毒载量检测,并提取血浆标本中HIVRNA,用RT-PCR方法扩增HIVpol区蛋白酶基因全序列与部分逆转录酶序列。所得扩增片段进行序列测定后,数据运用ContigExpress编辑校正后上传至斯坦福大学HIV耐药数据库进行比对,同时运用Bio-Edit、Clustal和Mega等软件进行系统发生分析。结果本研究中的17例(68%)患者的病毒载量在1000cp/ml以下,其中40%(10例)降至检测限之下。RT-PCR获得10例患者的扩增片段。对其序列亚型测试结果表明:7例属于HIV-1AE亚型,2例HIV-1B亚型,1例为HIV-1D亚型;耐药性分析表明:10份序列对PI(蛋白酶抑制剂)药物均表现为敏感,8份序列对NRTI(核苷类逆转录酶抑制剂)及NNRTI(非核苷类逆转录酶抑制剂)表现出至少对3种药物高度耐药,最常见的突变位点为G190A、K103N和M184V,造成对NVP、3TC的高度耐药。结论目前我省艾滋病患者的抗病毒治疗取得预期效果。随着治疗时间延长,患者免疫功能也逐渐恢复,但耐药性突变发生种类和数量有所增加,出现对现有各类一线药物不同程度的耐药。为保证可持续性治疗策略的施行,需加强对抗病毒治疗患者的依从性教育,同时加强耐药性监测,及时评估治疗失败者耐药性情况,必要时提供二线药品,减少我省HIV病毒耐药株的产生与传播,保障抗病毒治疗的有效进行。     

Subtype assignment and phylogenetic analysis of HIV type 1 strains in patients from Swaziland

Aim of this study was to assess HIV-1 subtype distribution and prevalence of transmitted mutations related to antiretroviral drugs in Swaziland. According to the WHO guidelines, 47 plasma samples from naive patients stored at HIV/AIDS National Reference Laboratory in Mbabane between 2002 and 2003, before the introduction of antiretroviral therapy in the country, were studied. HIV-1 RNA was extracted from the plasma samples, RT and protease regions of pol gene were amplified and sequenced. The mutations associated to drug resistance were defined as major or minor on the basis of the recommendations of the International AIDS Society-USA panel. A mutation associated to non nucleoside inhibitors (Y181I) was found in one case showing a prevalence of transmitted drug resistance <5% in Swaziland. No major mutations conferring resistance to protease and nucleoside RT inhibitors were found. Clade assignment was performed by phylogenetic analysis of pol gene. The general time-reversible model of substitution was used to study the phylogenetic relationships between sequences obtained from Swazi patients and sequences from neighbor countries. All patients were found to carry a C subtype. No phylogenetic relationships were detected within Swazi sequences, indicating the absence of epidemiological relationships among patients in study. Although local variants of subtype C have been recently recognized, phylogenetic analysis did not reveal the presence of significant cluster of Swaziland sequences within African variants. This finding may be explained by multiple introduction of C strains.     

Recombinant strains of HIV type 1 in the United Kingdom

Twenty-five recombinant (mosaic) HIV-1 genomes were detected among 151 samples comprising 118 non-B subtype sequences and 33 samples containing subtype B sequences. Seven of the 25 mosaic patterns were similar to characterized circulating recombinant forms (two A/E, four A/G, and one D/F) and one was a MAL-like A/D recombinant. Eighteen of the recombinants had evidence of subtype A sequences in at least one region of their genome. One sample was found to contain a novel recombinant form (pol F, env K). Two samples could not be characterized unambiguously as recombinant forms and a further one appeared to be a complex C/J/D/A genomic form. The majority of the mosaic genomes were recombinants between gag, pol, or env, whereas the C/J/D/A mosaic had cross-over breakpoints within pol. These findings suggest that almost 20% of non-B subtype isolates of HIV-1 circulating in the United Kingdom have mosaic genomes. This shows the diverse origin of HIV-1 strains circulating in the United Kingdom and may have implications for antiretroviral drug resistance.