双重实时荧光PCR与DNA测序分析及PCR-RFLP方法检测白细胞介素-6基因启动子区多态性方法的比较研究

目的比较双重实时荧光PCR与DNA测序分析以及PCR-RFLP三种检测方法对同一样本检测结果的一致性。方法分别采用三种方法对77例样本IL-6基因启动子区-572G／C，-597G／A2个位点多态性进行检测。结果在77例样本中，采用双重实时荧光PCR方法与DNA测序分析相比仅有3例结果不一致。用限制性内切酶BSrBI酶切，有20例与实时荧光PCR方法结果不一致。当PCR产物用限制性内切酶FokI酶切时，仅有5例被发现是GA型，另外两例未被检测出。结论双重实时荧光PCR方法与其它方法比较具有简单、准确、快速的特点，便于临床实验室大规模样本筛壹。     

双重实时荧光PCR与DNA测序分析及PCR—RFLP方法检测白细胞介素-6基因启动子区多态性方法的比较研究

目的比较双重实时荧光PCR与DNA测序分析以及PCR-RFLP三种检测方法对同一样本检测结果的一致性。方法分别采用三种方法对77例样本IL-6基因启动子区-572G／C，-597G／A2个位点多态性进行检测。结果在77例样本中，采用双重实时荧光PCR方法与DNA测序分析相比仅有3例结果不一致。用限制性内切酶BSrBI酶切，有20例与实时荧光PCR方法结果不一致。当PCR产物用限制性内切酶FokI酶切时，仅有5例被发现是GA型，另外两例未被检测出。结论双重实时荧光PCR方法与其它方法比较具有简单、准确、快速的特点，便于临床实验室大规模样本筛壹。     

白细胞介素-6启动子区单核苷酸多态性与肝细胞癌的相关性

肝细胞癌(HCC)的发病率逐年升高备受全球关注[1].目前认为其发病机制是遗传和环境等多因素相互作用的结果,其中也包括细胞因子调节作用.白细胞介素-6 (IL-6 )是一种重要的炎性细胞因子,有研究表明,IL-6 与其受体结合激发相关通路参与 HCC微环境构成、下游转录因子调控等过程,引起体内免疫、炎症反应并发挥着促进...     

白细胞介素6基因启动子区多态性与冠状动脉疾病的相关性研究

目的 探讨白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)基因启动子区-174G/C、-572C/G和-634C/G多态性对冠状动脉疾病(coronary heart disease,CHD)的发病易感性.方法 严格按照诊断标准,选取无亲缘关系的CHD患者126例(CHD组)及健康对照组150例提取基因组DNA,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-polymorphism,Restriction Fragment,PCR-RFLP)技术检测-174 G/C、-572 C/G和-634 C/G 3个多态性位点的基因型;采用HaploView4.0及SPSS11.5软件分析各位点基因型、等位基因频率及组间差异.结果 -572C/G位点及-634C/G位点的基因型频率分布在CHD组与正常对照组差异均有统计学意义(P＜0.05),CHD组-572C/G位点的等位基因G频率显著高于正常对照组(P＜0.05),-634C/G位点的等位基因G频率显著高于正常对照组(P＜0.05).连锁不平衡检验结果显示,IL-6基因这3个位点处于不连锁状态,D'＜0.5.结论 IL-6基因-174G/C和-572C/G多态性可能与CHD有关,携带有-572C/G和-634C/G多态性位点G等位基因的个体可能更容易患CHD.     

湖北地区汉族健康人群白细胞介素-1β基因5号外显子+3953C/T位点多态性的研究

目的 了解白细胞介素—1β基因(IL-1B)5号外显子 3953位点的单核苷酸多态性(SNP）在中国湖北地区汉族健康人群中的分布及其与不同种族比较的特点。方法 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)的方法,对251名湖北地区汉族健康者IL-lB( 3953)位点的SNP进行了检测,计算其基因型和等位基因频率,并结合文献进行了不同种族间的分析比较。结果 湖北地区汉族健康人群CC基因型频率最高,CT基因型次之,没有发现TT基因型;CC和CT基因型频率分别为0．96和0．04。与德国、西班牙等欧洲人群相比,湖北地区汉族健康人群C等位基因频率明显偏高,21等位基因频率明显偏低(P＜0．005),而与亚洲日本人群相似(P＞0．05)。结论 湖北地区汉族健康人群IL—1B( 3953)位点碱基突变率极低,其SNP在不同种族间的分布存在明显的差异。     

白细胞介素6基因启动子-572 C/G多态性与心绞痛的相关性研究

目的探讨白细胞介素6(IL-6)基因启动子-572C/G多态性各等位基因及基因型在心绞痛患者中的分布频率,并分析其基因型及血清水平与心绞痛的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测121例心绞痛患者及140例对照者IL-6基因启动子-572C/G多态性,同时用ELISA法检测心绞痛和对照者血清IL-6水平。结果心绞痛组IL-6血清水平显著高于对照组(P<0.01),IL-6基因启动子-572C/G基因型频率和等位基因频率在心绞痛组和对照组间比较差异有显著性(P<0.05),等位基因频率的相对风险分析发现,G等位基因携带者患心绞痛的风险是C等位基因的1.665倍(OR=1.665,95%CI:1.089~2.544);结论IL-6基因启动子-572C/G多态性与心绞痛的发病具有相关性。     

白细胞介素-6基因多态性与心血管疾病的研究进展

白细胞介素-6是具有多种生物学活性的细胞因子,具有调节血脂代谢、参与炎症反应、介导白细胞的粘附与聚集等多种功能。近年来,关于白细胞介素-6基因多态性与疾病的关系,以及在冠心病中的应用有了新的认识。本就白细胞介素-6的分子生物学特征、基因多态性、以及基因多态性与冠心病的关系作一综述。     

白细胞介素17基因多态性与疾病的相关性研究进展

白细胞介素(IL) 17是新发现的主要由CD4+效应T细胞即Thl7细胞分泌的一种前炎性细胞因子,具有促进成纤维细胞和单核细胞分泌多种炎性因子,招募中性粒细胞,增强T细胞启动效应等多种生物学活性.目前其基因多态性与疾病的研究已成为热点,现将国内外研究进展综述如下.     

老年脑梗死患者白细胞介素6基因调控区-174位点多态性与疾病发生发展的关系

目的：研究老年脑梗死患者的白细胞介素6(IL-6)基因调控区-174位点是否有基因变异，探讨其多态性与疾病的相关关系。方法：老年脑梗死患者38例，男22例，女16例；年龄60～90岁，平均69．0岁。健康对照组17例，男10例，女7例；年龄31～54岁，平均43．9岁。采用PCR扩增、限制性内切酶片段长度多态性(reatriction fragment length polymorphism，BFLP)分析和DNA序列测定，认识IL-6基因调控区-174位点的多态性；用ELISA定量分析老年脑梗死患者和正常人血清白细胞介素-6含量。结果：老年脑梗死患者IL6基因调控区-174位点均为GG型。老年脑梗死患者IL-6为(17．76&;#177;12．43)ng／L对照组为(2．35&;#177;3．50)ng／L，老年脑梗死患者外周血中IL-6含量显著高于正常对照(t=5．14，P&;lt;0．01)。结论：老年脑梗死患者未发现IL-6基因调控区-174位点的基因变异，-174位点的多态性可能没有参与脑梗死的发生和发展过程。     

青岛地区哮喘患者IL-6基因启动子-634C/G位点多态性研究

目的:了解白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因启动子区域单核苷酸多态位点-634C/G与青岛地区汉族人群过敏性哮喘的相关性.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法对青岛地区479例健康个体和481例过敏性哮喘患者IL-6基因启动子-634C/G多态性进行观察.结果:过敏性哮喘组与健康对照组CC、CG和GG基因型以及C和G等位基因频率分布均无统计学差异,携带GG、CG、CC基因型个体哮喘患病风险依次递增.结论:IL-6基因启动子-634C/G位点多态性与青岛地区人群过敏性哮喘发生无相关性,但携带CC等位基因型的个体过敏性哮喘的发病风险可能增加.     

荧光杂交探针实时聚合酶链式反应快速检测甘露聚糖结合凝集素启动子区基因变异方法的建立

目的建立用荧光杂交探针实时聚合酶链式反应（Real-timePCR）检测人甘露聚糖结合凝集素（MBL）启动子区基因变异新型的基因分型法——Tm基因分型法。方法收集30例健康献血员外周抗凝全血,提取基因组DNA。通过LightCycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线,根据熔解温度（Tm）峰值判定待测标本的基因变异类型。最后,用基因测序法检测PCR产物来验证Tm基因分型法的准确性。结果建立了新型的Tm基因分型法,且测定PCR产物的时间仅180min,检测结果与测序法完全吻合。结论Tm基因分型法检测人MBL启动子区基因变异快速、准确,重复性好,具有广泛的临床应用前景。     

用实时荧光定量PCR检测NAT2基因型及其意义

目的 探讨深圳地区汉族人中NAT2基因分布特征,为开展NAT2基因与肿瘤相关性研究和药物代谢性疾病诊治提供依据。方法将DNA浓度为40 ng/μl的标本进行1×100、1×101、1×102、1 ×103、1 ×104倍比梯度稀释,以验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度。采用实时荧光定量PCR结合TaqMan探针技术检测554名深圳汉族健康人NAT2基因282、341、481、590和857突变位点,并进行基因分型。同时用直接测序法对47名健康人标本进行平行检测,以验证和评价荧光定量PCR检测NAT2基因的敏感度、特异度和准确性。结果 经倍比梯度稀释试验验证实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度可精确至10-4ng/μl。采用实时荧光定量PCR从554名深圳汉族人中检出NAT2*4、*5、*6、*7、*11等位基因频率分别为64.6％( 358/554)、6.3％( 35/554)、25.3％ (140/554)、30.0％( 166/554)、0.6％( 3/554)。主要基因型NAT2* 4/*6、*6/*7、*13/*13或*12/*12或*4/*4、*4/*7、*7/*13、*12、*6/*13(*12)频率依次为12.3％(68/554)、8.3％ (46/554)、7.6％(42/554)、40.5％(224/554)、8.1％ (45/554)、7.2％ (40/554)、5.6％(31/554),7种基因型约占总基因型的89.6％ (496/554)。深圳地区汉族人中NAT2基因主要等位基因为*4、*6、*7、*13,表型以快乙酰化型和中间型为主,分别占40.5％( 224/554)、46.7％(259/554),慢乙酰化型仅占12.8％(71/554)。用荧光定量PCR和直接测序法平行检测47名健康人NAT2基因,与直接测序法比较,检测282、341、481、590、857位点的敏感度分别为88.2％ (30/34)、87.5％( 7/8)、80.0％ (4/5)、100.0％ (22/22)、93.8％ (15/16),特异度分别为100.0％ (13/13)、94.9％ (37/39)、100.0％ (42/42)、96.0％( 24/25)、96.8％( 30/31),准确性分别为91.5％(43/47)、93.6％( 44/47)、97.6％( 46/47)、97.9％ (46/47)、95.7％ (45/47)。结论实时荧光定量PCR检测NAT2基因的灵敏度、敏感度、特异度高,适用于临床及科学研究,深圳地区汉族人主要NAT2等位基因是*4、*6、*7,最常见慢乙酰化表型为*6/*7,这为与NAT2基因相关的代谢性疾病及肿瘤研究提供了数据。     

聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛查胰岛素受体基因突变

目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（ＲＣＲＳＳＣＰ）和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择８９例非胰岛素依赖型糖尿病患者,ＰＣＲ扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子１７～２１）,进行ＳＳＣＰ电泳,银染色后,对突变样品进行序列分析。结果发现１１例外显子１７和１例外显子２０的异常电泳条带,外显子１７的突变经顺序分析,为ＣＡＣ１０５８→ＣＡＴ１０５８的杂合和纯合多态性突变。结论ＰＣＲＳＳＣＰ结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。     

湖北地区汉族变应性哮喘患儿Tim-3启动子区基因多态性研究

目的 探讨湖北地区汉族儿童T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白．3（Tim-3）启动子区1541位C〉T和574位G〉T单核苷酸变异及其与变应性哮喘易感性之间的关系。方法 分别采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和引物特异PCR-核酸序列测定技术检测湖北143例哮喘患儿和72名健康儿童Tim-3启动子区1541位C〉T和574位G〉T单核苷酸变异，讣算基因型和等位基因频率。结果 湖北地区健康儿童Tim-3启动子区1541位C／C、C／T和T／T基因型频率分别是0．961、0．039和0，而哮喘患儿频率分别为0．935、0．065、0，其基因型频率与对照组差异无统计学意义（r=0．3825，P=0．5362）；湖北健康儿童中Tim-3启动子区574位G／G、G／T和T／T基因型频率分别为0．992、0．008和0，而哮喘患儿频率分别为0．941、0．059、0，两组基因型频率差异有统计学意义（χ^2=4．134，P=0．042）。结论 湖北汉族儿童Tim-3启动子区存在多态性变异，其中574位G〉T多态性可能与湖北汉族儿童变应性哮喘易感性有关。     

快速检测乙型肝炎病毒C基因启动子联合点突变

目的　研究聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析（ Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ） 法检测乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） Ｃ 基因启动子区 Ｔ１７６２／ Ａ１７６４ 联合点突变的有效性。方法　将４４ 份慢性乙型肝炎患者的血清 Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ结果同测序结果进行综合分析。结果　在４４ 份慢性乙型肝炎患者的血清中,有１２ 份血清 Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ的结果为单纯突变株感染;１０ 份为突变株与野生株混合感染;２２ 份为单纯野生株感染,与测序结果相吻合。结论　 Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ检测 Ｈ Ｂ Ｖ／ Ｃ 基因启动子区 Ｔ１７６２／ Ａ１７６４ 联合点突变具有快速、简便以及敏感性高、特异性强等优点,且可用于观察 Ｔ１７６２／ Ａ１７６４ 变异株的动态变化。但是此法也有一定的局限性。     

荧光多聚酶链反应测定线粒体乙醛脱氢酶-2 Glu504Lys多态性

目的 建立一种荧光多聚酶链反应测定线粒体乙醛脱氢酶-2 Glu504Lys多态性的方法.方法 以水解探针技术(TaqMan)为基础,设计相应的引物和荧光探针,PCR反应的Mg2+浓度和探针浓度进行优化,同时对本方法的灵敏度和精密度进行了研究,通过PCR产物直接测序对准确度进行评价.结果 优化后的Mg2+和探针浓度分别为2.5 mmol/L和1.0 μmol/L,批内循环阈值(Ct)值的变异系数为1.38%(n=20),批间Ct值的变异系数为1.48%(n=20);在25 μl反应体系中,人基因组DNA在5.0×102～5.0×106 pg浓度范围内可以得到满意的结果.本法确定150份标本的基因型与PCR产物直接测序法比较,结果完全一致.结论 本方法快速、灵敏、可靠,适合于临床实验室和大规模测定线粒体乙醛脱氢酶-2Glu504Lys多态性.     

白细胞介素13基因多态性与支气管哮喘的关系

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种免疫细胞及炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病,近几年其患病率和复发率有逐年增高的趋势,严重影响患者的身心健康。白细胞介素13(IL-13)作为最重要的细胞因子之一,在哮喘的发病中起重要作用。现已发现十余个与哮喘密切相关的IL-13基因位点,这些基因位点的单核苷酸多态性与IL-13的表达、血清总Ig E水平及气道高反应性等密切相关。本文就IL-13基因+1923C→T、+2044G→A(rs20541)及-1112 C→T(rs1800925)多态性与哮喘关系的相关研究予以综述。     

一种基于单核苷酸多态性位点的定量检测异基因造血干细胞移植后嵌合率的新方法

目的 建立一种单核苷酸多态性-聚合酶链反应(SNP-PCR)定量检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的新方法 ,探讨其可行性、准确性及优越性.方法 利用18个SNP位点筛选移植前每一对供、受者,采用实时定量PCR(RQ-PCR)对筛选出的差异位点行嵌合率定量分析,通过倍比稀释、模拟嵌合与微卫星重复序列-PCR(STR-PCR)、性染色体双色荧光原位杂交(XY-FISH)和融合基因的定量检测,比较、验证方法 的准确性及敏感度.结果①利用内参质粒标准品扩增的17次标准曲线,平均斜率为-3.39,平均截距为39.97,相关系数均＞0.995,扩增效率接近理想水平;批内差及批间差分别为0.50%和1.10%,在可控范围;与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上;可重复敏感度达0.01%.②40例移植患者中,95%以上可以筛选出供、受者差异SNP位点;SNP-PCR与STR-PCR结果吻合率达96.7%,与XY-FISH结果比较差异无统计学意义(P＞0.05);SNP-PCR与特定白血病融合基因检测结果比较,完全嵌合(CC)标本均未检出肿瘤相关的融合基因,部分嵌合(MC)标本融合基因均为阳性.结论 SNP-PCR检测嵌合率准确、敏感、易行,具有极高的临床应用前景,克服了STR-PCR竞争抑制及扩增平台期偏倚的缺点,可以替代其进行临床常规检测.     

简便HBV基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立

目的 建立简便HBV基因型S基因PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分型方法(以下简称“简便PCR-RFLP法”),并评价其临床应用价值.方法 临床诊断研究.查阅并比较GenBank中128株HBV(基因型A～D型)S基因片段(S区nt253-687),设计限制性内切酶Hinf Ⅰ、Ear Ⅰ、Apo Ⅰ鉴别A～D基因型分型方法,并评价简便PCR-RFLP法检测HBV DNA的最低检测下限、重复性;然后,用该方法检测50例慢性乙型重型肝炎患者的HBV基因型,同时用直接测序法验证简便PCR-RFLP法检测HBV基因型的一致性.结果 建立了简便PCR-RFLP法HBV基因分型的方案,通过限制性内切酶Hinf Ⅰ一次酶切就可分出我国流行的B型、C型、D型等毒株及B/C混合型.随机抽取3份标本,不同稀释浓度下,用简便PCR-RFLP法重复检测HBV基因型,分型结果均与原血清完全一致,且最低检测下限约为7 ～9 IU/ml.经Hinf Ⅰ酶一步酶切后,用简便PCR-RFLP法从50例患者标本中,检出B型23份、C型10份;经直接测序法验证,从PCR产物中检出B型23份、C型10份,2种方法检测B、C型基因结果完全一致(Kappa=1.00,P=0.001),简便PCR-RFLP法检出B/C混合型9份,优于PCR产物直接测序法(0份,x2=18.00,P=0.001).Hinf Ⅰ酶一步酶切后分出的ABD型8份,进一步酶切及应用PCR产物直接测序法检测均为B型变异株.结论 建立的简便PCR-RFLP法对HBV基因分型有较高的灵敏度和重复性,且在检出混合基因型方面具有优势,更为简便.     

解偶联蛋白2启动子-866G／A多态性与中国北方儿童肥胖病相关性研究

目的：研究解偶联蛋白2（UCP2）基因启动子-866G/A单核苷酸多态性与中国北方儿童肥胖病遗传发病机制的相关性。方法病例组选取2010年1～9月于北京儿童医院内分泌科就诊且无血缘关系的儿童肥胖病患者220例。对照组选自无血缘关系的成年健康献血员220例。用血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA,UCP2基因启动子-866G/A单核苷酸多态性分析采用PCR-RFLP法,并选取部分标本进行测序分析。结果（1）UCP2基因启动子-866A等位基因在中国肥胖病儿童中的频率与正常对照组相近,无统计学差异（44．8％ vs．46．4％,χ2＝0.224,P＝0.685）。（2）GG、GA和AA基因型在患者频率分布为34．5％、41．4％及24．1％;在对照组中的分布为27．3％、52．7％及20.0％,三者在患者与对照中的频率分布无显著性差异（ P＞0.05）。包含等位基因A的基因型AA和GA基因型频率之和在对照组中的频率增加,但无统计学差异（65．5％vs．72.7％,P＝0.122）。按性别进行分层分析,肥胖病男童与对照组的基因型频率分布尚无显著性差异（ P＝0.05）,在女童中亦无显著性差异（ P＝0.512）。结论 UCP2基因启动子-866 G/A单核苷酸多态性与中国儿童肥胖病遗传发病机制未见显著相关性。 UCP2基因启动子-866 G/A多态性与肥胖病的遗传发病机制的相关性存在一定的人种差异。