结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼相关基因快速检测的应用研究

目的 利用DNA芯片检测技术直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)相关的耐药基因(rpoB、katG/inhA),评价DNA芯片检测技术临床应用的可行性.方法 对586份涂阳痰标本使用L-J培养并用终点法确定其耐药性,同时利用DNA芯片检测技术检测痰标觋本中结核分枝杆菌的rpoB、katG/inhA常见基因突变位点的突变情况,比对两种方法的检测结果,对不符合的菌株测定其相应DNA序列,评估上述试验的准确性.结果 (1)586份涂阳痰标本,其中3(+)163份、2(+)204份、1(+)217份,培养阳性584份.耐药结果显示,对INH、RFP敏感的菌株分别为361株和327株,耐药菌株分别为223株和247株,其中低浓度耐药、高浓度敏感菌株分别为93株和59株,低浓度、高浓度均耐药菌株分别为130株和188株.(2)耐药基因特异性片段扩增阳性标本367份(62.8%)、阴性217份(37.2%).对INH耐药相关基因(katG/inhA)突变检出率是28.4%,突发发生位点集中在katG315位密码子(89.8%);对RFP耐药相关基因(rpoB)突变检出率是55.9%(137/247),突变发生位点主要在rpoB 531和rpoB 526位密码子,发生率分别是68.6%和16.1%.(3)对L-J药敏结果与DNA芯片检测结果不符的菌株进行DNA序列分析,发现有漏检现象.结论 DNA芯片技术直接检测样本中结核分枝杆菌的相关耐药基因存在可行性,如直接应用于临床样本检测,关键要解决样本中DNA的提取效率、PCR的扩增效率和试验的质量控制.     

结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因检测芯片的研究

目的建立用于检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的基因芯片，并与基因测序和常规药物敏感性试验进行比较，探讨其使用价值。方法根据结核分枝杆菌katG基因突变的规律，设计不同的探针，制备可检测katG基因突变的芯片，并且同时检测药物敏感株和耐药株的katG的变异情况。结果结核分枝杆菌临床分离株共137株，至少耐1种抗结核药物共97株（70．8％）。耐异烟肼的比例为32．8％（45／137）。敏感株katG基因扩增阳性率为100％。耐INH菌株katG的阳性率为88．9％（40／45）。PCR检测katG阳性率为91．1％（41／45）。耐INH菌株katG的缺失率为8．9％。katG315位密码子的突变依次为AAC（32．5％，13／40），ACC（15．0％，6／40），ACA（10．0％，4／40）。ATC（5．0％，2／40）和AGC（5．0％，2／40）。基因芯片检测、药物敏感性试验和基因测序的结果一致。结论本研究建立的检测结核菌katG基因突变的基因芯片技术敏感性高，特异性强，可用于结核菌的快速药物敏感性试验评价。     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法的建立

目的建立结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变的快速检测方法。方法根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列，自行设计覆盖rpoB、katG、inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针，并检测临床样品中结核分枝杆菌的基因突变情况，以此来判断耐药结果。结果在56个利福平耐药菌株中，有50个菌株都在rpoB基因上榆出有突变，利福平耐药突变检出率为89．3％（50／56）；有30个利福平敏感菌株rpoB基因上都未检出突变。有58个异烟肼培养的耐药菌株中有47个在katG或inhA基因上检出有突变，异烟肼耐药突变检出率为81．0％（47／58）；有30个异烟肼敏感菌株katG或inhA基因上未检出突变。结论用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核分枝杆菌耐药性的检测。     

应用多重PCR-单链构象多态性分析同时检测耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析(multiplexpulymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,multi-PCR-SSCP)方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能.方法 根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物.采用multi-PCR-SSCP技术,一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌.新方法的有效性通过116株临床分离株(70株耐异烟肼,66株耐利福平)的验证.结果 名 Multi-PCR-SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性,以细菌培养和药敏试验结果为金标准.116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变,其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功.与H37Rv标准株相比,46株katG基因突变,14株inhA基因突变,58株rpoB基因突变.38株katG和rpoB,4株inhA和rpoB,4株inhA和katG同时突变,还有2株3个基因都有突变.multi-PCR-SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80%、82%,特异度分别为100%和92%.结论 multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌,有望成为临床指导用药的好方法,为深入研究耐药基凶检测奠定了良好的基础.     

结核分枝杆菌利福平耐药基因的检测

以药物敏感试验为标准,应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法对６８例利福平耐药菌株和２０例利福平敏感菌株进行测定,结果８８例结核分枝杆菌均扩增出目标ＤＮＡ条带,１０例非结核分枝杆菌和８例非分枝杆菌未出现目标ＤＮＡ条带,所用引物扩增ｒｐｏＢ基因２１５ｂｐ片段为结核分枝杆菌复合群异性的。     

DNA芯片快速检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 开发快速检测耐利福平结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因突变的DNA芯片。方法 根据结核菌rpoB基因序列设计探针并制作基因芯片，从临床样品中分离出结核菌的基因组DNA，PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段，荧光标记后与芯片上含有的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交，同时与DNA直接测序法测定序列比较。结果 35株耐利福平结核菌中有91．4％(32／35)用直接测序法检测出存在rpoB基因突变，DNA芯片的检测效率为71．4％(25／35)。结论 用DNA芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核菌耐药性检测。     

探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素耐药突变

目的评价探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平(RIF)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)及链霉素(SM)耐药突变的方法学应用价值。方法用PCR探针熔解曲线法检测110株结核分枝杆菌临床分离株RIF、INH、EMB及SM耐药突变情况,以传统的比例法药物敏感性试验检测结果为标准,评价探针熔解曲线法的敏感性、特异性和一致率,并应用测序方法分析结果不一致菌株的耐药突变位点。结果以比例法检测结果为标准,熔解曲线法检测RIF耐药的敏感性为98.51%,特异性为95.35%,诊断符合率为97.27%;检测INH耐药的敏感性为94.12%,特异性为95.24%,诊断符合率为94.55%;检测EMB耐药的敏感性为88.64%(39/44),特异性为75.76%(50/66),诊断符合率为80.91%(89/110);检测SM耐药的敏感性为82.98%,特异性为80.95%,诊断符合率为81.82%。两种检测方法结果不符菌株的测序结果大部分与熔解曲线法的检测结果一致。结论探针熔解曲线分析法检测速度快,敏感性高,特异性强,可用于结核分枝杆菌耐药突变的快速检测。     

结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验的系统评价

目的评价9种检测结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验方法的准确性。方法计算机检索PubMed、EMbase等数据库和手工检索相关期刊，全面收集结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验的研究，依据QUADAS评价纳入诊断试验的质量，并对结果进行Meta分析。结果最终纳入12个研究。Meta分析结果显示：硝酸盐还原法与比例法相比，以及BACTECMGIT960与BACTEC460TB相比，其敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及SROC曲线下面积分别为92％、99％、31．84、0．12、0．9836和98．5％、96％、13．66、0．035、0．9871；其余检测方法，如MODS、MB／BacT、MYDBA和TTC亦显示了较好的敏感度和特异度。结论硝酸盐还原检测法可代替比例法作为结核分枝杆菌耐异烟肼的筛查试验。BACTEC MGIT 960可代替BACTEC460检测系统作为结核分枝杆菌耐异烟肼的确诊试验。     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的 研究杭州地区结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对利福平（RFP）的耐受与rpoB基因突变的关系。方法 随机挑选了90例结核杆菌感染的病例。选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验，PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段（580bp）；测定扩增片段的序列。并与美国国立生物信息中心（www．ncbi．nlm．nih．gov／nucleotide）检索获得结核杆菌野生株（利福平敏感株）序列（登陆号：AJ749948）作对比分析。结果 结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株。51例敏感株，与药敏实验的方法检测的结果完全一致。测定的11株临床分离的耐药株中，526位或531位有突变，其中526位有突变的有7株，占耐药测定株63．6%，531位突变的有4株。占耐药测定株36．4％。未见两位点同时突变。检测的11株敏感株，未见526位或531位有突变。结论 杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关，与国外的报告基本相似。但526位突变占耐药测定株高达63．6％。如此高比例目前国内外未见相似报道。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法。     

MPT64在MTB利福平和异烟肼耐药性检测方法中的应用

目的 建立一种以MPT64为指标的结核分枝杆菌（MTB）耐药性检测的快速方法,探讨MPT64在MTB利福平（RFP）和异烟肼（INH）耐药性检测中的应用。方法 应用胶体金免疫层析法（GICA）分别检测MTB敏感株和耐多药株在含（观察组）与不含（对照组）RFP、INH的Middlebrook 7H9液体培养基上培养3、7、10 d的培养液中的MPT64,通过凝胶成像仪白光源拍照进行条带灰度分析（Image Jab Software 3.0）,比较敏感株和耐多药株间的灰度比值的差异,依据受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分析确定RFP、INH耐药的灰度比值界值;以比例法检测结果为金标准,评价新建方法的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 对照组中,随着培养时间的延长,12株MTB敏感株和11株耐多药株的灰度比值增大;观察组中,敏感株在不同的培养时间的灰度比值没有显著变化,而耐多药株则明显增大。3、7、10 d敏感菌与耐多药菌在药物培养基中MPT64检测灰度比值差异均有统计学意义（P均< 0.05）。依据观察组灰度比值分别绘制以MPT64指示的RFP和INH耐药性检测的ROC曲线,两者的3 d AUC分别为0.84和0.77,灰度比值界值均为0.05;7、10 d AUC均为1.00,7 d的灰度比值界值分别为0.23与0.20;10 d的灰度比值界值分别为0.49和0.48。GICA检测MPT64用于34株MTB的RFP、INH耐药性鉴定的准确度分别为97%和94%,灵敏度分别为93%和86%,特异度均为100%,阳性预测值均为100%,阴性预测值分别为95%和91%。结论 GICA检测MPT64于MTB培养7 d时能准确检测抗结核药物RFP、INH耐药性,MPT64可作为MTB药敏试验的有效检测指标。     

刃天青显色法检测结核分枝杆菌的耐药性

目的用刃天青显色法检测结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物的耐药性,并探讨该法的临床应用价值。方法来自河南省3家结核病医院的共240株结核分枝杆菌分别用刃天青显色法检测异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、硫酸链霉素(SM)的耐药性,并与比例法作比较。结果刃天青显色法检测平均时间为8d,与比例法相比结果一致性好,INH、RFP、EMB、SM 4种药物的折点浓度分别为0.25、2.0、4.0、2.0μg/mL。结论刃天青显色法检测结核分枝杆菌的耐药性具有成本低、快捷、操作简便、准确等优点,为结核耐药检测提供了一种较好的方法。     

反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变，并评价其临床应用价值。方法 应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测，所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果 62株对利福平耐药的菌株中，54株碱基突变被准确鉴定，灵敏度为87．1％(54／62)，阳性预测值为：100％；40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定，特异性为100％，阴性预测值为83．3％(40／48)；准确度为92．2％(94／102)。与测序法结果符合率为99％。结论 以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高，无假阳性结果，因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。     

探针熔解分析法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的应用和评价

目的 评价PMA技术检测MTB对INH耐药突变的价值,调查INH耐药突变发生特征.方法 MTB标准株H37Rv来自国家结核病参比实验室,1株INH敏感株和1株katG S315TACC突变株来自厦门市疾病预防控制中心,7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株来自深圳慢性病防治中心、河南省疾病预防控制中心、中国人民解放军第309医院和厦门市疾病预防控制中心.707份MTB临床分离株来自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心,126份MTB涂阳痰标本来自厦门市同安区疾病预防控制中心.MTB标准株H37Rv、7株MTB INH耐药株和833份临床标本均采用厦门致善结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒热裂解法提取基因组DNA,1株INH敏感株和1株katG S315T ACC突变株采用AxyPrepTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.熔解曲线分析所检标本与野生型对照在katG315位密码子、inhA启动子区(- 17～-8位点)、ahpC启动子区(-44～-30以及-15 ～3位点)及inhA94位密码子的熔解温度(Tm值)差异判断标本是否发生INH耐药突变.3×105拷贝/反应的野生株和katG S315T ACC突变株以10倍梯度稀释至300拷贝/反应,分析PMA技术的灵敏度.用PMA技术检测7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株,评价特异性,并就其中5种耐药突变进行重复性检验.测序验证PMA技术对833份标本INH耐药性的临床检测效能.结果 PMA技术从核酸提取到结果判断可在3小时内完成,在标准96孔实时PCR仪器上可同时检测46份标本.对野生株和katG S315T ACC突变株的灵敏度均为300拷贝/反应,能够同时区分9种INH耐药相关点突变或缺失,5种耐药突变的Tm值标准偏差均在0.5℃之内.检出的162份突变标本与测序验证结果均一致.临床标本验证突变率为19.4％( 162/833),在所检出的14种INH耐药突变katGS315T( AGC →ACC)、inhA启动子区- 15C→T和katG S315N (AGC→AAC)这3种突变占INH耐药突变标本的83.3％(135/162).结论 PMA技术可快速、灵敏、特异检测结核INH耐药突变.     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

聚合酶链反应—增强化学发光检测结核分枝杆菌

目的 探讨微孔板杂交技术结合增强化学发光（ECL）检测结核分枝杆菌（MTB）。方法 同时应用聚合酶链反应（PCR）－ECL、PCR－比色法与PCR电泳检测60例活动性肺结核和54例健康对照痰标本，比较结果。结果 PCR－ECL、PCR－比色法与PCR电泳总阳性率分别为76.7%、63.3%、50.0%，其中PCR－ECL阳性率显著高于PCR电泳（P＜0.05)；对涂片阳性标本，阳性率分别为85.7%、85.7%、71.4%，差异无显著性（P＞0.05)；对涂片阴性标本，阳性率分别为73.9%、56.5%、43.5%，PCR－ECL阳性率高于PCR电泳（P＜0.05)。另外PCR－ECL、PCR－比色法与PCR电泳特异性分别为92.6%、96.3%、96.3%，差异无显著性（P＞0.05)。结论 PCR－ECL灵敏度高，能提高临床标本MTB检出率，尤其是对涂片阴性痰标本，并且该方法操作简单，结果客观。     

耐多药结核分枝杆菌临床株耐药性分析

目的探讨贵阳市肺科医院住院结核病患者中的耐药情况,为临床诊断和治疗耐多药结核病（MDR-TB）提供可靠的科学依据。方法对2004年1月至2009年8月期间住院患者的临床分离株进行菌型鉴定后,进行药物敏感性试验,分析不同类型结核病患者的耐药情况。结果 2 318株结核分枝杆菌总的耐多药率为23.8%,初始耐多药率为12.1%,获得性耐多药率为63.8%。结论贵阳市肺科医院收治的结核病患者耐药率较高,应尽快加强耐药结核病患者的防治工作,减少和避免MDR-TB患者的产生。