高效液相色谱-荧光法测定SLE患者血清色氨酸及其代谢产物

目的建立一种同时测定血清色氨酸(tryptophan,Trp)、犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)和犬尿喹啉酸(kynurenic acid,Kyna)的高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD),并用此法检测SLE患者血清中Trp及其代谢产物Kyn、Kyna的含量。方法血清标本经0.624 mol/L的高氯酸溶液去除蛋白质后取上清液20μl直接进样分析测定。色谱柱为Hypersil C18柱,流动相为0.20mol/L醋酸锌、8.3 mmol/L醋酸和2.5%的乙腈;流速为1.5 ml/min;荧光检测激发波长和发射波长在0~11 min分别为365nm和480 nm,11~15.5 min变换为344 nm和404 nm,15.5~20 min为254 nm和404 nm。采用建立的方法测定体检健康者和SLE患者血清Trp、Kyn和Kyna的含量。结果Trp的线性范围为0.610~196μmol/L,最低检出浓度为0.005μmol/L,平均回收率为103.71%;Kyn线性范围为0.049~98μmol/L,最低检出浓度为0.025μmol/L,平均回收率为97.45%;Kyna线性范围为1.05...     

高效液相色谱——紫外、荧光双检测器同时测定人尿中犬尿氨酸和犬尿喹啉酸

目的建立高效液相色谱（HPLC）同时测定人尿中犬尿氨酸（KYN）和犬尿喹啉酸（KYNA）方法。用KYNA／KYN比值评价人体犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）活性。方法采用HPLC测定KYN、KYNA,分析柱为安捷伦HCC18反相色谱柱;流动相为10mmol／L乙酸钠-乙酸缓冲液：7％乙腈=93：7;流速1mL／min;检测器波长：紫外365nm,荧光344nm（激发）／398nm（发射）。结果KYN和KYNA保留时间分别为6．9和11．5min。水溶液标准与标准加入工作曲线斜率差异无统计学意义（KYN：P=0．4068;KYNA：P=0．6462）。KYN和KYNA的平均回收率分别为98．74％±7．53％、95．17％±8．17％;稳定性试验的变异系数（CV）分别为3．35％和0．88％;精密度CV分别为2．73％和2．79％;最低检测限分别为0．4和0．2μmol／L。30份健康成年人尿样的KYNA／KYN比值为2．45±1．54。尿中KYNA与KYN含量呈正相关关系（r2=0．3758,P〈0．001）。结论测定方法灵敏、准确、稳定。KYNA／KYN比值评测KAT活性具有简便、实用等特点,可用于相关疾病的临床辅助诊断和基础研究。     

高效液相色谱法同时测定血清色氨酸和犬尿氨酸浓度的方法建立及应用

目的建立一种高效液相色谱-紫外检测法同时测定血清中色氨酸(Trp)和犬尿氨酸(Kyn)浓度的方法。方法色谱柱采用Agilent Hypersil ODS(125.0mm×4.0mm,5μm),流动相为15mmol/L乙酸钠缓冲液(pH4.0)和乙腈95∶5(V/V),流速为0.8ml/min,柱温25℃,紫外检测λKyn=360nm,λTrp=278nm。结果Kyn和Trp的保留时间分别为3.3min和5.2min,线性范围分别为0.083~21.000μmol/L和2.650~678.000μmol/L,检测限分别为0.028μmol/L和0.053μmol/L,日内和日间相对标准偏差分别低于5%和10%,回收率分别为91.99%~113.89%和95.81%~118.82%。结论该方法简便、快速、特异,适合于临床检测。     

高效液相色谱-荧光法同时测定血清中的色氨酸和酪氨酸

目的建立一种高效液相色谱（HPLC）-荧光法（FD）同时测定血清色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的方法。方法色谱条件：Megres C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,内径为5μm）,流动相为10%乙腈溶液,流速为1.2 mL/min,Tyr和Trp的荧光检测激发波长和发射波长分别为λexTyr=228 nm、λexTrp=285 nm和λemTyr=306 nm、λemTrp=353 nm。血清样本经5%高氯酸溶液去除蛋白质后取上层清液直接进样进行分析测定。且对样本的保存方法进行了探讨。结果 Tyr的保留时间为3.4 min,线性范围为0.275~275μmol/L,最低检出浓度为0.004μmol/L,回收率为90.5%~108.8%。Trp的保留时间为7.6 min,线性范围为0.490~196μmol/L,最低检测浓度为0.005μmol/L,回收率为88.8%~97.2%。Tyr和Trp的日内、日间测定的相对标准偏差均〈5%,苯丙氨酸、5-羟色胺、犬尿喹啉酸、犬尿氨酸和肌酐等物质对该法均无干扰。样本应-20℃冰冻保存。结论该方法简便、快速、敏感、特异,可同时测定血清Tyr和Trp,适合于临床和科研应用。     

健康国人血清犬尿氨酸和犬尿氨酸/色氨酸含量比值参考值范围的建立

目的建立我国正常人血清犬尿氨酸(KYN)及犬尿氨酸/色氨酸含量(KT)比值参考值范围。方法采用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)检测86名健康成人血清KYN和色氨酸(TRP)含量,并计算KT比值。结果正常成人血清KYN为0·364~3·022μmol/L,平均(1·426±0·542)μmol/L,KT比值为11·008~47·528mmol·L-1·M-1,平均(29·271±9·315)mmol·L-1·M-1。不同年龄组之间,血清KYN、TRP含量及KT比值差异均无统计学意义(P>0·05);性别之间,血清KYN、TRP含量及KT比值差异均有统计学意义(P<0·05)。结论建立了健康国人KYN及KT比值参考范围,为相关疾病的辅助诊断、疗效观测及发病机制等研究提供相应参数。     

原发性高血压患者血浆色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸浓度的变化

目的通过测定血浆色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)和犬尿喹啉酸(KYNA)浓度,探讨外周吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)活性与原发性高血压(EH)的关系。方法采用高效液相色谱法(HPLC)测定100例EH患者和80名健康体检者(对照组)血浆TRP、KYN和KYNA浓度,计算产物/底物的百分比来评价酶活性,即IDO活性=KYN/TRP×100%,KAT活性=KYNA/KYN×100%。结果 EH组血浆TRP浓度为(59.85±9.89)μmol/L,明显高于对照组[(48.19±7.72)μmol/L,P<0.001];KYN浓度为(2.01±0.48)μmol/L,明显低于对照组[(2.17±0.43)μmol/L,P<0.05]。EH组和对照组血浆KYNA浓度分别为(24.10±9.12)、(23.59±7.27)μmol/L,二者差异无统计学意义(P>0.05)。EH组IDO活性为3.40%±0.85%,明显低于对照组(4.54%±0.81%,P<0.001);而KAT活性为1.20%±0.36%,明显高于对照组(1.09%±0.27%,P<0.05)。EH组血浆TRP浓度与年龄呈负相关(r=-0.316,P=0.001),而对照组二者之间无明显相关性(r=-0.208,P=0.064)。EH组和对照组血浆IDO活性均与年龄呈正相关(EH组:r=0.264,P=0.008;对照组:r=0.305,P=0.006)。2组血浆KYN、KYNA浓度及KAT活性与年龄均无明显相关性。结论EH组血浆TRP浓度明显增高而KYN浓度明显降低,提示外周TRP-KYN代谢途径的IDO活性可能与EH有关。     

HPLC-UV检测法同时测定血浆色氨酸和犬尿氨酸的方法学研究

目的 建立一种同时测定血浆中Trp和Kyn浓度的HPLC-UV检测法.方法 以3-硝基酪氨酸(3-N-Tyr)为内标,采用Agilent Hypersil ODS色谱柱进行分离.流动相中醋酸缓冲液( 15 mmol/L,pH 5.5):乙腈为94∶ 6(v/v);流速为0.8 ml/min;柱温:25℃;紫外程序化检测波长:0～4 min,360 nm;4～5 min,302 nm.选取2010年9-12月重庆市九龙坡区第一人民医院15例慢性乙型肝炎患者、8例慢性肾炎患者、10例血小板减少性紫癜患者以及15名健康体检者,用该方法检测其血浆Trp、Kyn水平并计算Kyn/Tp比值;各指标在上述4组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法.结果 Kyn与Trp的保留时间分别为2.9 min和4.4 min,线性范围分别为0.44～18.30μmol/L和3.67～470.00 μmol/L,检测限分别为0.014 μmol/L和0.122 μmol/L.Kyn与Trp的日内变异均小于3％,日间变异均小于4％.平均回收率均在92.29％～104.40％之间.用该方法测定临床标本,健康对照组、慢性肾炎组、血小板减少性紫癜组以及慢性乙型肝炎组血浆中Kyn浓度分别为(1.59±0.28)、(2.73±0.56)、(2.69±0.44)和(1.54±0.48) μmol/L,Trp浓度分别为(59.8±10.0)、(46.1±11.7)、(58.5±8.0)和(41.4±13.1)μmol/L,Kyn/Trp比值分别为(0.027 4±0.007 5)、(0.061 6±0.0165)、(0.0467±0.0091)和(0.038 3±0.007 5),差异均有统计学意义(F值分别为23.734,8.463和20.921,P均＜0.01).结论 所建立HPLC-UV检测法可同时测定血浆中Kyn和Trp浓度,适合于临床检测.     

再生障碍性贫血中色氨酸和犬尿氨酸的检测方法及意义

目的 建立检测再生障碍性贫血(Aplastic Anemia,AA，)血清中必需氨基酸——色氨酸（Trp）及其代谢产物犬尿氨酸（Kyn）水平的方法，探讨其与疾病之间的关系。方法 应用反向高效液相色谱法检测，以荧光检测器检测色氨酸、以紫外检测器检测犬尿氨酸的血清水平 结果 再障患者血清Trp浓度明显低于正常对照，Kyn浓度明显高于正常对照；再障动物模型结果与患者血清结果相同（P<0.05）。结论 在再障发病过程中，色氨酸限速酶IDO的表达水平和活性均较正常明显增高，促进色氨酸向犬尿氨酸转化，色氨酸的不足导致细胞内的“色氨酸饥饿状态”从而抑制T细胞的活化和增殖，是机体免疫系统自我调节的一种重要保护机制。     

犬尿喹啉酸在肠易激综合征中的作用机制

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS) 是一种常见的肠道功能紊乱性疾病,以持续或间歇性腹痛及排便习惯改变为主要临床表现,常伴有焦虑、抑郁等精神症状,严重影响患者生活质量。目前,IBS的病因及发病机制尚不明确,现有研究表明IBS是由内脏感觉异常、肠道感染与炎症反应、肠道菌群失调、社会心理等多种因素共同作用的结果。近期研究表明IBS患者中存在肠道菌群-犬尿氨酸(kynurenine, KYN)代谢紊乱,且KYN代谢产物犬尿喹啉酸(kynurenic acid,KA)与炎症反应、疼痛刺激及心理症状相关,在IBS中可能起到抗炎、缓解疼痛等保护性作用,有望成为诊断和治疗IBS的新方法。本文就KYN代谢途径及其代谢产物KA在IBS中的作用机制作一综述,以期为临床相关专业人员提供参考和借鉴。     

高效液相色谱法紫外检测血清色氨酸

测定血清游离色氨酸、血清总色氨酸及其比值对肿瘤的诊断及肝脏病变程度和预后的判断有重要的临床意义。目前多用荧光法检测,本文报道高效液相色谱法紫外检测血清色氨酸。     

高效液相色谱-荧光检测法在慢性肾功能不全患者血清芳香族氨基酸检测中的临床价值

目的 建立同时测定血清AAA含量的HPLC-FLD法,探讨CRI患者血清AAA含量变化及其临床应用价值。方法血清标本来自于100名健康体检者和80例CRI患者。将CRI患者按2002年美国肾脏基金会(NKF)诊断分期标准进行分期：CKD 2期4例、CKD 3期12例、CKD 4期12例和CKD 5期52例;按CRI不同病因分组：慢性肾炎型32例、糖尿病型36例和高血压型12例。血清经高氯酸去蛋白后,离心取上清液测定,外标法定量。采用Megres C18色谱柱,流动相为乙腈：水（体积比为1∶9）,流速为1.0 ml/min,荧光检测器在不同时间段设定特定波长对血清AAA进行测定。对健康对照组和CRI患者组血清中AAA总量、Tyr、Phe和Trp含量及不同分期和不同病因CRI患者血清Tyr、Phe和Trp含量进行比较,同时评价血清AAA总量诊断CRI的敏感度与特异度。结果Tyr、Phe和Trp线性范围分别为0.550～275.000、3.050 ～1 220.000和0.049～49.000 μmol/L,最低检测限分别为0.014、0.500和0.005 μmol/L,平均回收率分别为100.9％、101.3％和98.5％,日内精密度为2.32％～3.92％（平均为3.13％）,日间精密度为3.18％ ～4.20％（平均为3.58％）。CRI患者组血清AAA总量、Tyr、Trp含量及Tyr/Phe比值分别为(135.74±12.23)、(52.27±8.25)、(21.49±4.25) μmoL/L和[0.87（0.68 ～1.05）],低于健康对照组的(174.47±11.57)、（63.53±4.68）、(44.22±3.67) μmol/L和[0.97（0.94～1.00）],差异均有统计学意义（t=- 14.709、4.452、22.100,U=266.000,P均＜0.05）。不同分期CRI患者Tyr、Phe和Trp含量差异无统计学意义;Tyr含量在慢性肾炎组、高血压组和糖尿病组间差异无统计学意义,Phe在慢性肾炎组与高血压组、慢性肾炎组与糖尿病组间差异有统计学意义（U= 114.00、395.00,P均＜0.05）,Trp在慢性肾炎组与糖尿病组间差异有统计学意义(U=349.00,P＜0.05)。血清AAA总量诊断CRI的敏感度、特异度分别为90％ (72/80)和100％ (100/100)。结论HPLC-FLD法测定血清AAA简便、快速,敏感度高及特异度好,同时测定血清AAA含量对CRI患者的诊断和评价有一定价值。     

高效液相色谱法测定人血清甜菜碱方法的建立

目的 采用柱前衍生高效液相色谱法-紫外检测法建立一种测定人血清甜菜碱浓度的方法.方法 以对溴苯乙酰溴和18-冠醚-6溶于乙腈制成衍生液,将其与甜菜碱反应形成的衍生物用Supelcosil LC-SCX色谱柱进行分离.流动相为乙腈∶水体积比90∶10,含16 mmol/L的氯化胆碱,等度洗脱,流速为0.8 ml/min,检测波长为259 nm,利用甜菜碱标准品绘制标准曲线,外标法定量检测20名健康大学生志愿者血清甜菜碱.结果 甜菜碱的测定线性范围为6.25～200.00 μmol/L,回归方程Y=1 568.1X-2 747.5,R2=0.999 8.最低检测限为3.0 μmol/L.批内不精密度为1.88%～3.79%(平均3.24%),批间不精密度为3.14%～6.76%(平均4.39%).方法 回收率为95.89%～102.86%(平均99.16%).结论 成功建立一种检测人血清甜菜碱浓度的方法,适用于实验室及临床常规检测.     

高效液相色谱法在类风湿关节炎患者血清TRP和KYN检测中的应用与临床价值

目的 探讨高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FLD)同时测定血清色氨酸(TRP)和犬尿氨酸(KYN)对诊断类风湿关节炎(RA)的临床意义.方法 血清标本加等量5%(V/V)高氯酸溶液去除蛋白,离心取上清液20 μl,直接进样分析.色谱柱为HpemilC_8柱(300 mm×6.0 mm i.d,10 μm);流动相为0.25 mol/L醋酸锌和50 mmol/L醋酸溶液(含3%乙腈),流速为1.5 ml/min;0～10 min荧光检测器的激发波长和发射波长分别为365 nm和480 nm,10 min后激发波长和发射波长分别变换为254 nm和404 nm.同时,用该方法测定120名健康成人和110例RA患者血清TRP、KYN和TRP/KYN比值(K/T),并评价其诊断RA的敏感度、特异度和方法学效能.结果 血清标本的KYN和TRP保留时间分别为8.1和11.5 min,两者分离良好.KYN线性范围为0.098 ～19.600 μmol/L,最低检测浓度为0.04 μmol/L;回收率为90.8%～96.2%,日内变异系数为3.68%,日间变异率为4.97%.TRP的线性范围为4.9～196.0μmol/L.最低检测限为0.005 μmol/L,回收率为92.6～106.9%,13内变异系数为3.63%,日间变异系数为4.44%.在本试验的色谱条件下测定苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、犬尿喹啉酸(KYNA)、5-羟色胺(5-HT)和Cr均无干扰.RA组患者血清KYN含量和K/T比值[(2.06±0.38) μmol/L和(55.46±5.81)×10~(-3)]与健康对照组[(1.51±0.35)μmol/L和(32.54 ±9.00)×~(-3)]比较,均显著升高(U=3 251.0,t=10 741,P均为0.000),而RA组TRP含量[(38.24±5.27)μmol/L]与健康对照组[(47.52±5.79)μmol/L]比较,则显著降低(t=10.399,P=0.000).K/T比值诊断RA的敏感度、特异度分别为83.6%(92/110)、85.8%(103/120).结论 HPLC-FLD同时测定血清TRP和KYN的方法精密度、回收率、抗干扰能力、线性范围等均符合临床检测要求.K/T比值可作为RA的辅助性诊断指标.     

反相高效液相色谱紫外法检测人血清尿酸

目的探讨日本临床化学会(JSCC)推荐的检测人血清尿酸(UA)的反相高效液相色谱紫外(HPLC-UV)法是否可作为候选参考方法来验证同位素稀释质谱法、评价常规方法。方法对反相HPLC-UV法进行复现并进行方法学评价。观察尿酸酶处理人血清样本后的色谱以评价其特异性;检测系列标准液的UA水平并绘制标准曲线,观察线性范围;用朗道公司质控品评价精密度;用UA标准液评价回收率;分别用有证参考物SRM 909b(Ⅰ和Ⅱ)、国家一级标准物质GBW 09176、GBW 09175、GBW 09174评价正确度,并与2008年国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)参考实验室RELA(ring trials for reference labora-tories)结果进行比对;用改良Bland-Altman图评价5种常规检测系统与反相HPLC-UV法间的偏差。结果尿酸酶处理后UA色谱峰消失;本法的线性范围为2.08～1 785μmol/L;批内变异系数(CV)均<0.3%,批间CV均<0.4%,日间CV均<2.3%,总CV均<2.7%;平均相对回收率为96.0%～100.6%;与SRM909bⅠ和Ⅱ靶值的偏移分别为-2.5%、-2.3%;与GBW09176、GBW 09174、GBW 09175靶值的偏移分别为0.29%,-0.74%和0.06%;与参加RELA比对的另3家实验室的平均值进行比较,水平1偏移为0.35%,水平2为-0.69%;Hitachi、Beckman Coulter、Roche、Dade、Vitros常规检测系统检测人血清UA与反相HPLC-UA法的相关系数分别为0.998 9、0.996 5、0.999 2、0.999 2和0.998 7,与反相HPLC-UA法的偏差均小于5%的生物学变异。结论本法特异、简便、快速,精密度好,正确度高,与具有良好溯源的常规测定系统具有良好的相关性和一致性,可推荐作为人血清UA测定的候选参考方法。     

高效液相色谱法测定人血清中褪黑素的浓度

目的用反相高效液相色谱法测定血清中褪黑素的含量。方法采用荧光检测器检测20例自愿者血清中的褪黑素。结果血清中褪黑素最低检测浓度为0.5pg·ml-1,检测限0.2pg,褪黑素在1.0～500pg·ml-1之间呈线性关系,回归方程Y=65744.7x-220.6(r=0.9989,P<0.05),回收率>94.7%,日间、日内变异系数均在10%以下。结论用反相高效液相色谱法测定血清中褪黑素的含量灵敏、快速、准确,为褪黑素在体内代谢等研究提供方法,对临床合理补充外源性褪黑素具有指导性。     

Low-dose acetylsalicylic acid therapy monitored with ultra high performance liquid chromatography

Objectives

Assessment of compliance in patients on low-dose acetylsalicylic acid (ASA) therapy is limited to interview, pill counting, witnessed ASA intake, and measurement of thromboxane B₂ levels. We validated a new, sensitive assay for analyzing blood levels of ASA and the metabolite salicylic acid (SA).

Design and methods

Blood samples were withdrawn from 10 healthy volunteers and 50 patients with stable coronary artery disease, before and after intake of 75 mg ASA. Plasma was mixed with acetonitrile, and 2-methylbenzoic acid was added as internal standard. After filtration, ASA and SA were quantified with ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). Separation was accomplished with an isocratic flow of acetonitrile in phosphate buffer pH 2.5, and a Zorbax RRHD C₁₈ analytical column. Detection was achieved with wavelength photodiode array detection set at 237 nm.

Results

The ASA- and SA-assay showed linearity (r² > 0.999) within the range of 0.2–200 μg/mL, and with detection limits of 170 ng/mL and 53 ng/mL. The intra- and inter-day imprecision for ASA and SA were 2.2–5.9%, 3.4–11.7% and 1.8–8.0%, 3.8–9.4%, respectively. Recovery was between 89 and 103% for both assays. More than 60 coadministered drugs were investigated for interference, and only one drug interfered with the ASA-assay and none with the SA-assay. ASA was measurable 1 h after intake of 75 mg ASA, and SA was measurable 1 and 6 h after ASA intake.

Conclusion

We developed a fast and reliable UHPLC assay with a high sensitivity and selectivity, suitable for monitoring of compliance in patients treated with low-dose ASA.