小分子干扰RNA下调硬脂酰辅酶A去饱和酶-1对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)下调硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用设计合成的SCD-1 siRNA转染人肝癌细胞HepG2细胞株,转染后细胞分为3组:空白对照组(未做任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和SCD-1 siRNA组(SCD-1 siRNA转染)。采用反转录聚合酶链反应检测HepG2细胞SCD-1 mRNA的表达,噻唑蓝法检测HepG2细胞的增殖,用流式细胞术检测SCD-1 siRNA对HepG2细胞凋亡和细胞周期的影响。结果 SCD-1 siRNA组的SCD-1 mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);转染后24、48、72 h,SCD-1 siRNA组HepG2细胞增殖较空白对照组和阴性对照组明显减慢(P<0.01);SCD-1siRNA组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);SCD-1 siRNA组HepG2细胞在合成前期(G0/G1期)的细胞比例明显高于空白对照组和阴性对照组,在合成期(S期)和合成后期(G2/M期)的细胞比例均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。空白对照组和阴性对照组HepG2细胞在SCD-1 mRNA表达、细胞增殖、细胞凋亡率及细胞周期方面差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 siRNA可通过下调HepG2细胞SCD-1基因的表达,抑制HepG2细胞的增殖,并促进其凋亡。     

RNA干扰沉默COX-2对鼻咽癌细胞增殖凋亡及细胞周期的影响

[摘要] 目的 筛选COX-2基因的有效RNA干扰序列,研究沉默COX-2表达对鼻咽癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法 人工合成双链的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染鼻咽癌C666-1细胞后,RT-PCR法检测COX-2的mRNA含量表达变化,筛选出沉默COX-2表达的有效RNA干扰序列。MTT法检测细胞增殖的变化,DAPI染色检测细胞凋亡,流式细胞法进行细胞周期分析。结果 设计合成的anti-COX-2b siRNA能够使COX-2 mRNA表达下降90%以上,COX-2基因沉默后,鼻咽癌细胞周期出现G0/G1期阻滞,增殖能力下降,但对凋亡无明显影响。结论 RNA干扰沉默COX-2的表达能够抑制细胞增殖,阻滞细胞周期,可以成为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供新的思路,进行深入研究。 [关键词] 鼻咽肿瘤 环氧合酶-2 RNA干扰     

慢病毒载体介导siRNA抑制survivin对人卵巢上皮癌细胞作用的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默survivin基因表达对人卵巢上皮癌A2780细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计并合成靶向survivin的小分子干扰RNA(siRNA),构建慢病毒表达载体,MTT比色法检测细胞增殖率;流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡指数;Real-timePCR和Western blot方法观察对A2780细胞survivin mRNA水平及蛋白质表达的抑制效率。结果:survivin-siRNA能有效封闭survivin基因的表达,使survivin的mRNA相对水平明显降低(P<0.05);survivin-siRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);survivin-siRNA使细胞G0/G1期细胞百分比明显增加,促进细胞的凋亡(P<0.05)。结论:利用RNA干扰技术沉默survivin基因的表达可以显著抑制人卵巢上皮癌A2780细胞的增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,靶向survivin的RNA干扰技术在卵巢癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤U251细胞化疗敏感性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNU)作用下转染Aurora A siRNA前后U251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNU对转染Aurora A siRNA后U251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNU作用下转染后U251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。     

SiRNA干扰DLL4表达对A549细胞周期和凋亡的影响

目的 筛选DLL4基因的特异性小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),探讨DLL4对A549 细胞增殖、周期、凋亡的影响.方法 设计、合成并筛选针对DLL4的siRNA,转染A549细胞后,以RT-PCR和Western blot检测DLL4 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡变化,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 DLL4 siRNA能够明显下调A549细胞中DLL4 mRNA和蛋白的表达.并能抑制细胞的增殖(抑制率为43.85％);促进细胞凋亡(P＜0.05),G2/M期细胞比例明显增加(P＜0.05).结论 DLL4在肺癌细胞中也有表达,下调其表达后,能够抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡.     

Eg5基因在神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡中的作用

目的探讨Eg5基因对神经母细胞瘤(NB)细胞增殖和凋亡的影响。方法取2株NB细胞株SHSY-5Y和NBL-S,分别转染针对Eg5基因的小干扰RNA(siRNA),分为细胞对照组(用等体积的水代替siRNA,只含有脂质体,未转染细胞)、siRNA对照组(转染siRNA对照)和siRNA干扰组(转染Eg5 siRNA),每组6孔,每孔1×10~6个细胞。使用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测Eg5 mRNA表达水平的变化;使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入实验和克隆形成实验检测下调Eg5表达对NB细胞增殖的影响;使用流式细胞术检测下调Eg5表达对NB细胞凋亡和细胞周期的影响。结果荧光定量PCR检测结果显示,siRNA干扰组Eg5 mRNA表达水平与细胞对照组和siRNA对照组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);EdU掺入实验和克隆形成结果表明,siRNA干扰组细胞中DNA的合成量和细胞克隆数量低于细胞对照和siRNA对照组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞的凋亡比率低于siRNA干扰组细胞的凋亡比率,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期的检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞中G0/G1期所占比率<50%,而siRNA干扰组细胞中G0/G1期所占比率>70%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在NB细胞中使用siRNA下调Eg5表达,能够抑制NB细胞增殖,促进细胞凋亡。     

Nucleostemin基因特异性RNA干扰对HeLa细胞体外增殖能力的影响

目的:研究nucleostemin (简称NS)基因特异性RNA干扰对HeLa细胞的增殖和细胞周期的影响.方法:①将NS特异性siRNA真核表达质粒经脂质体转染导入HeLa细胞,筛选NS阳性转染HeLa细胞克隆,作为silencer组用于实验,对照组为HeLa细胞组,②检测silencer组和对照组细胞生长曲线、细胞增殖率和细胞周期.结果:与对照组相比,Silencer组HeLa细胞增殖速率明显降低,细胞处于G0/G1期明显增多,S期则明显减少,DNA异倍体数量明显降低.结论:NS特异性siRNA真核表达质粒转染的HeLa细胞,其细胞增殖速率受到明显抑制.     

Rab1A siRNA对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制

目的观察Rab1A对宫颈癌He La细胞增殖和凋亡的影响并探讨其分子机制。方法应用siRNA干扰Rab1A基因表达,将He La细胞分为空白对照组、阴性对照组和Rab1A siRNA组,空白对照组不做处理,阴性对照组转染阴性对照siRNA。Rab1A siRNA组转染Rab1A特异性siRNA。MTT比色法分析Rab1A对宫颈癌He La细胞增殖的影响;采用流式细胞仪分析对细胞周期和细胞凋亡的影响;Western blot观察Rab1A siRNA对Cyclin D1、GRP78、Bcl-2和Bax表达的影响。结果与阴性对照组相比,Rab1A siRNA组He La细胞的Rab1A mRNA和蛋白的表达均显著下调;Rab1A siRNA抑制宫颈癌He La细胞增殖;与阴性对照组相比,Rab1A siRNA组He La细胞的S期细胞数量显著减少(P<0.05),G1/G0期细胞数量显著增加(P<0.05),Rab1A siRNA组He La细胞的早期凋亡和晚期凋亡显著增加(P<0.01);Rab1A siRNA组与阴性对照组相比,Cyclin D1和Bcl-2在蛋白水平的表达显著下调(P<0.01),GRP78和Bax在蛋白水平的表达显著上调(P<0.01)。结论 Rab1A通过调控Cyclin D1的表达促进宫颈癌He La细胞增殖,通过调控GRP78、Bcl-2和Bax表达抑制细胞凋亡。     

HSP70 siRNA对宫颈癌HeLa细胞HSP70表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的通过体外实验观察HSP70的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞株增殖及凋亡的影响,探讨HSP70在HeLa细胞增殖和凋亡中的功能。方法针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。在脂质体2000的介导下转染HeLa细胞,同时转染空载体为阴性对照及不加任何试剂的空白对照。转染48h后,应用半定量RT-PCR,Westernblot检测HeLa细胞HSP70mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测HeLa细胞的生长抑制率;AO/EB染色法观察HeLa细胞形态学变化;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布情况。结果与对照组相比,转染pHSP70-siRNA组HSP70的mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01),表明Phsp70-siRNA质粒转染能有效降低HSP70的表达;细胞生长抑制率明显增高(P<0.05),且在48h时细胞抑制率达到最大;在荧光显微镜下观察到HeLa细胞出现凋亡形态;流式细胞术结果显示pHSP70-siRNA组细胞凋亡率显著高于对照组,且G0/...     

脂质体转染survivin siRNA对A549细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨脂质体转染survivin siRNA 对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响.方法:人工合成抑制survivin基因的siRNA片段,通过脂质体转染到A549细胞内,倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化;用四氮唑盐(M1Tr)法观察转染后24h,48h,72h对细胞增生的影响;流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数;RT-PCR检测survivin mRNA的表达.结果:转染siRNA后的A549细胞,细胞增殖受到显著抑制,细胞明显出现凋亡,survivin基因mRNA表达显著下降.结论:应用RNA干扰靶向抑制survivin基因可以显著抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡.survivin可能成为肺癌基因治疗的一个新靶点.     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞,用WST-8法检测细胞增殖抑制率;RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例;Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后,明显抑制K562细胞增殖,各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05);②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平,各浓度组间差异无显著性(p>0.05);③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期;④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群,各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05),细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达,抑制细胞的增殖,诱导凋亡,但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

长链非编码RNA PVT1沉默对K562细胞增殖的影响

目的 筛选靶向抑制长链非编码RNA(lncRNA)浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)的小干扰RNA(siRNA),并探讨其对人白血病细胞株K562细胞增殖的影响.方法 针对PVT1设计合成PVT1-siRNA1、2、3、4序列及无关对照siRNA(SC-siRNA)序列.利用HiperFect转染试剂将各条siRNA转入K562细胞,实验依此分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组和SC-siRNA组,并设空转组和细胞组.转染后用实时定量RT-PCR检测细胞中PVT1 RNA的相对表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期.结果 转染24、48 h后siRNA4组PVT1 RNA水平下降,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01), 而siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组PVT1 RNA水平与细胞组相比差异无统计学意义(P>0.05);转染24、48、72 h后siRNA4组细胞增殖抑制率都增加,与SC-siRNA组和空转组相比差异均有统计学意义(P<0.01);转染48、72 h后siRNA4组出现了G1期阻滞,G1期细胞比例增加,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 PVT1-siRNA可通过阻滞细胞周期的进展而抑制K562细胞的增殖.     

新基因FAM92A1-289与增殖细胞核抗原PCNA相互作用的验证

目的 利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白FAM92A1-289和PCNA(增殖细胞核抗原)之间的相互作用.方法 构建带有嘌呤霉素抗性的载体CMV-SP6--GFP-FAM92A1-289和真核表达载体PCDNA3.1-PCNA,先将CMV-SP6-GFP-FAM92A1-289载体转染入Hela细胞,通过最合适浓度的嘌呤霉素筛选,得到稳定表达FAM92A1-289的Hela/ FAM92A1-289细胞,再将载体PCDNA3.1-PCNA转染入Hela/ FAM92A1-289细胞,利用免疫共沉淀来验证FAM92A1-289和PCNA之间的相互作用.结果 构建的重组表达载体经双酶切、测序鉴定正确,稳定表达株 Hela/ FAM92A1-289细胞构建成功,PCNA单克隆抗体沉淀蛋白复合物后,用GFP抗体进行Western blot法检测,检测出了GFP-FAM92A1-289蛋白.结论 免疫共沉淀证明了FAM92A1-289和PCNA之间存在相互作用.     

RNA沉默Pin1表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术沉默Pinl表达后,观察其对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法采用脂质体介导法将Pinl干扰片段PinlsiRNA和对照片段controlsiRNA转染入乳腺癌细胞系MDA—MB一23l后,利用RT—PCR和Westernblot法检测Pinl基因在mRNA和蛋白水平的表达情况,并应用MTT法、Transwell法和AnnexinV—FITC／PI试剂盒及流式细胞仪技术分析检测Pinl对MDA—MB一23l细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果Pinl在乳腺癌细胞系中高表达。与未处理组及转染对照片段controlsiRNA组相比,沉默Pinl表达后,PinlmRNA（P〈0．05）和蛋白（P〈0．05）表达均明显下降,细胞生长增殖能力[P〉0．05（第1天）,P〈0．01（第2—4天）]减弱,细胞侵袭数目（6．61±0．53,P〈0．05）减少,细胞凋亡率（31．5％±3．06％,P〈0．05）显著增加。结论沉默Pinl表达后可抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭,促进乳腺癌细胞凋亡。     

小分子干扰RNA下调星形细胞上调基因1的表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)下调星形细胞上调基因1(AEG-1)表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。方法卵巢癌细胞株SKOV3分为3组:空白对照组(不做任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和观察组(AEG-1 siRNA转染)。用反转录聚合酶链反应观察AEG-1 siRNA对AEG-1基因表达的影响;甲基噻唑基四唑法观察AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和细胞周期的影响。结果空白对照组和阴性对照组AEG-1 mRNA表达、SKOV3细胞增殖、细胞凋亡率及在DNA合成前期(G0/G1期)、合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组SKOV3细胞AEG-1 mRNA表达显著低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞增殖在24、48、72 h较空白对照组和阴性对照组均显著减慢,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01);观察组SKOV3细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),而合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),差异均有统计学意义。结论 siRNA可通过下调卵巢癌SKOV3细胞AEG-1基因的表达,抑制其增殖,促进其凋亡。     

干扰组蛋白去甲基化酶基因表达对Ishikawa细胞增殖凋亡的影响

目的研究SiRNA干扰组蛋白去甲基化酶（JARID1A）基因表达对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖凋亡的影响。方法 Ishi-kawa细胞转染JARID1A特异性的SiRNA;将Ishikawa细胞分成sicon组、sicon＋e2组、siJARID1A组和siJARID1A＋e2组,RT-PCR检测四组细胞孕激素受体（progesterone receptor,PR）mRNA表达,Western Blot检测四组细胞PR蛋白,MTT法观察细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果干扰JARID1A能显著上调PR表达,E2可进一步上调PR表达（P〈0.01）;E2能促进Ishikawa细胞增殖,转染SiRNA 48 h后细胞增殖受到抑制;转染SiRNA抑制细胞G1、G2/M期（P〈0.05）。结论 JARID1ASiRNA能有效抑制Ishikawa细胞增殖。     

siRNA沉默MACC1基因表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨siRNA沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达对Hela宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法通过脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转入Hela细胞中,RT-PCR及western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力,western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E,基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。结果与siRNA NC组比较,siRNA MACC1组中MACC1蛋白及mRNA表达量降低(P0.01),细胞活力及侵袭能力下降(P0.01),细胞周期阻滞在G1期,cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表达量下调(P0.01)。结论siRNA MACC1能显著的抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭,可能与下调ERK磷酸化水平有关。