辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞中p38MAPK表达的影响

目的探讨辛伐他汀对p38信号通路在人脐静脉内皮细胞中表达的影响，以期阐明其在防治糖尿病大血管并发症中的作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，分别以糖尿病特有因素：高葡萄糖、高胰岛素、糖基化终末产物(AGE)和过氧化氢刺激人脐静脉内皮细胞，同时用辛伐他汀进行干预，用ELISA法检测不同刺激及干预因素条件对HUVEC中p38MAPK磷酸化蛋白表达的影响。结果高葡萄糖、高胰岛素、AGE和过氧化氢均可激活p38MAPK，使其磷酸化表达量增加，辛伐他汀可抑制p38MAPK磷酸化蛋白表达增加。结论辛伐他汀在预防糖尿病大血管并发症的作用机制中，可能与p38MAPK有关。     

P38信号通路在人脐静脉内皮细胞表达环氧化酶-2中的作用

目的：探讨P38信号通路(P38MAPK)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达环氧化酶-2(COX-2)的作用，从而研究P38MAPK在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法：分别以高葡萄糖、糖基化终产物(AGE)、高胰岛素和过氧化氢刺激HUVEC；检测P38MAPK和COX-2在HUVEC的蛋白表达。以P38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理HUVEC后，再用上述四种因素刺激HUVEC，检测COX-2在HUVEC的蛋白表达。结果：高葡萄糖、AGE、高胰岛素和过氧化氢均可独立激活P38MAPK，使磷酸化P38MAPK表达量增加，COX-2蛋白表达量也增加；SB203580预处理后，COX-2表达被显著抑制。结论：P38MAPK调控COX-2的表达，它是COX-2的上游信号分子，可能是动脉粥样硬化发生的始动信号之一。     

高糖刺激人脐静脉内皮细胞丝裂素活化蛋白激酶P38的表达

目的：探讨丝裂素活化蛋白激酶P38（P38MAPK）在糖尿病血管并发症中的作用。方法：采用体外培养和Western-blot等方法，以不同浓度D－葡萄糖及不同时间刺人脐静脉内皮细胞系，分别检测人脐静脉内皮细胞系P38MAPK的蛋白表达。结果：随D－葡萄糖浓度增加，P38MAPK磷酸化蛋白表达量增加；延长刺激时间，P38MAPK磷酸化蛋白表达量亦随之增加。结论：高糖引发的P38MAPK表达异常，可能在糖尿病血管并发症的发生、发展中起关键作用。     

亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK和VEGF表达的调控

目的:探讨丝裂素活化蛋白激酶p38(p38MAPK)和血管内皮生长因子(VEGF)的关系,从而研究p38MAPK和VEGF在糖尿病肾病中的作用及硒在抗糖尿病肾病中的作用机制.方法:分别以高葡萄糖、糖基化终产物,高胰岛素和过氧化氢孵育大鼠肾小球系膜细胞(RMCs);以p38MAPK特异抑制剂SB203580和亚硒酸钠分别预处理RMCs,再给予上述四种刺激因素孵育RMCs,观察RMCs p38MAPK和VEGF蛋白表达.结果:高葡萄糖、糖基化终产物、高胰岛素和过氧化氢均可独立激活p38MAPK,使其磷酸化表达量增加,VEGF表达也明显增加:SB203580预处理后,VEGF表达被显著抑制;亚硒酸钠预处理后,p38MAPK磷酸化被明显抑制,同时VEGF表达显著降低.结论:p38MAPK调控VEGF的表达,表明p38MAPK和VEGF参与了糖尿病肾病的发生发展;亚硒酸钠可通过抑制p38信号通路而抑制VEGF的表达,从而有效地防治糖尿病肾病.     

p38MAPK对大鼠肾小球系膜细胞表达COX-2的调控

目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的关系,从而研究p38MAPK和COX-2在糖尿病肾病中的作用机制.方法:分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1;先以p38MAPK特异抑制剂SB203580预处理细胞系HBZY-1,再给予上述4种因素孵育细胞系HBZY-1,观察细胞系HBZY-1、p38MAPK和COX-2的表达.结果:高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物均可独立激活p38MAPK,使其磷酸化表达量增加,COX-2表达也明显增加;SB203580预处理后,COX-2表达被显著抑制.结论:p38MAPK调控COX-2的表达,表明p38MAPK是COX-2的上游激酶之一,p38MAPK和COX-2在糖尿病肾病的发生发展过程中起重要作用.     

亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38丝裂原活化蛋白激酶和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的影响

目的:观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1表达p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)的影响,从而研究p38MAPK和PPARγ在糖尿病肾病形成中的作用及硒在防治糖尿病肾病中的作用机制.方法:在以下3种条件下培养细胞系:(1)分别以一定浓度高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和AGEs刺激细胞系HBZY-1一定时间;(2)先给予p38MAPK特异性抑制剂SB203580或亚硒酸钠预处理细胞后,再分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物4种因素孵育细胞系HBZY-1;(3)以不加任何刺激培养细胞系作为对照.RT-PCR法观察各种情况下细胞系HBZY-1 PPARγ mRNA的表达,Western印迹法观察磷酸化p38MAPK的表达.结果:4种刺激因素均可作为独立因素激活p38MAPK,使其磷酸化表达量增加,PPARγ表达量显著减少;SB203580能显著增加细胞系HBZY-1 PPARγ表达;亚硒酸钠能明显抑制细胞系HBZY-1p38MAPK磷酸化表达,而显著增加细胞系HBZY-1 PPARγ表达(P＜0.01).结论:在大鼠肾小球系膜细胞,p38MAPK对PPARγ具有拮抗作用,亚硒酸钠明显增加细胞系HBZY-1 PPARγ表达,并具有类似PPARγ激动剂的作用.     

p38MAPK对大鼠肾小球系膜细胞表达PPAR-γ的影响

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (peroxisome proliferator-activated receptors-γ, PPAR-γ)的关系,从而研究p38MAPK和PPAR-γ在糖尿病肾病中的作用机制.方法 分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1;先分别以p38MAPK特异抑制剂SB203580预处理细胞系HBZY-1,再给予上述4种因素孵育细胞系HBZY-1,观察细胞系HBZY-1 p38MAPK和PPAR-γ的表达.结果 高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物均可独立激活p38MAPK,使其磷酸化表达量增加,PPAR-γ表达明显减少;SB203580预处理后,PPAR-γ表达显著增加.结论 在大鼠肾小球系膜细胞,p38 MAPK对PPAR-γ具有拮抗作用,表明PPAR-γ的激活可能具有直接的肾脏保护作用.     

P38MAPK信号通路在大鼠肾小球系膜细胞表达VEGF中的作用

目的研究P38信号通路(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)在大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells, RMCs)表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)中的作用,从而探讨P38MAPK在糖尿病肾病中的作用机制.方法分别以高葡萄糖、糖基化终末产物(Advanced glycation end product ,AGEs)、高胰岛素和过氧化氢孵育RMCs;以P38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理RMCs,再以上述4种因素孵育RMCs,观察RMCs P38MAPK和VEGF蛋白的表达.结果 4种刺激因素均可独立激活P38MAPK,VEGF表达量也明显增加;SB203580预处理后,VEGF表达被明显抑制.结论 P38MAPK是VEGF的上游激酶,P38MAPK和VEGF可能参与了糖尿病肾病的发生发展.     

p38MAPK对大鼠肾小球系膜细胞表达NF-κB和COX-2的调控

目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB ) 和环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2)之间的关系,从而研究p38MAPK和NF-κB、COX-2在糖尿病肾病中的作用机制.方法:分别以一定浓度的高葡萄糖(25 mmol/L)、高胰岛素(100 mmol/L)、过氧化氢(100 μmol/L)和糖基化终产物(100 mg/L)孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1一定时间;先分别以一定浓度的p38MAPK特异抑制剂SB203580(10 μmol/L)预处理细胞系HBZY-1,再给予上述4种因素孵育细胞系HBZY-1,观察细胞系HBZY-1 p38MAPK、NF-κB和COX-2的表达.结果:高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物均可独立激活p38MAPK,使其磷酸化表达量增加,NF-κB、COX-2表达也明显增加,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);SB203580预处理后,NF-κB、COX-2表达显著降低,与相应刺激组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:p38MAPK可通过激活NF-κB、COX-2而诱导DM时肾脏的损害, p38MAPK和NF-κB、COX-2在糖尿病肾病的发生发展过程中可能起重要作用.     

亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP-1的影响

目的:观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1表达p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)的影响,从而研究硒在防治糖尿病肾病(DN)中的作用机制. 方法:分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终末产物(AGEs)刺激HBZY-1细胞;先给予100 nmol/L亚硒酸钠预处理后,再分别以上述4种刺激因素孵育HBZY-1细胞,分别检测HBZY-1细胞p38MAPK和MCP-1的表达并比较. 结果:4种刺激因素均可作为独立因素,导致HBZY-1细胞p38MAPK和MCP-1表达量增加;亚硒酸钠能抑制上述4种因素所致的p38MAPK和MCP-1的表达. 结论:亚硒酸钠通过抑制p38MAPK和MCP-1在HBZY-1细胞的表达, 从而有效防治DN的发生发展,表明硒在DN的防治过程中发挥积极作用.     

晚期糖基化终末产物在糖尿病大鼠骨质疏松发病中的作用及胰岛素潜在的防护机制

目的探讨循环中晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）在糖尿病大鼠骨质疏松发病中的作用及胰岛素潜在的防护机制。方法将3月龄雄性SD大鼠用链脲佐菌素（streptozotocin STZ）诱导成速发型糖尿病大鼠模型,随机分为胰岛素治疗组（n=10）和模型组（n=10）并以正常大鼠作对照组（n=10）。20周后下腔静脉采血处死大鼠,用Hitachi-850型荧光分光光度计测定血清中AGEs含量的变化,取一侧股骨和胫骨行X线拍片和骨密度测量,对侧胫骨近端制作病理标本,股骨行RT-PCR测定RAGE的含量。结果20周后,模型组与对照组相比,骨质疏松明显,股骨BMD、血清中AGEs、骨组织中RAGE的表达与对照组比均有统计学意义(P＜0．01)。胰岛素治疗组与模型组相比,股骨BMD明显升高 (P＜0．01),血清中AGEs减少(P＜0．01),骨组织中晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)的表达下降。结论骨组织中AGEs和RAGE相互作用是糖尿病骨质疏松的重要致病机制之一,胰岛素对糖尿病大鼠骨质疏松具有防护作用,其作用机制可能与严格控制血糖、抑制AGEs的合成、阻断骨组织中AGEs和RAGE相互作用有关,从而提高大鼠骨密度,改善骨质量。     

p38MAPK/eNOS信号通道在胰高血糖素样肽-1抑制AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨p38MAPK信号通道在胰高血糖素样肽-1（GLP-1）拮抗糖基化终末产物（AGEs）诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡
的作用。方法实验组分为对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组、AGEs+抑制剂组及AGEs+GLP-1+抑制剂组,western
blot技术检测p-p38MAPK/p38MAPK、p-eNOS/eNOS蛋白表达情况,Annexin V/PI流式检测细胞凋亡率。结果与对照相比较,
单独加入AGEs或GLP-1可分别导致p-p38MAPK蛋白表达水平明显上升（P=0.001）或下降（P<0.001）;与对照组相比AGEs可
显著降低p-eNOS表达水平（P=0.007）,而予以GLP-1或p38MAPK抑制剂（SB203580）预处理后,受抑制的eNOS蛋白表达水平
再次显著升高（P=0.004）;在AGEs 组加入SB203580 或GLP-1 预处理后,AGEs诱导的细胞凋亡率均显著下降（P<0.001,P<
0.001）。结论GLP-1至少部分通过抑制p38MAPK蛋白磷酸化,上调磷酸化eNOS蛋白的表达,对人脐静脉内皮细胞起到抗凋
亡的保护作用。
     

螺内酯对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞P-p38MAPK和TGF-β1变化的影响

目的：研究糖尿病肾病（diabetic nephropath,DN）大鼠肾小球系膜细胞p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的表达及螺内酯对其的影响。方法：以高糖孵育大鼠肾小球系膜细胞（mesangial rell,MC）24h,用细胞免疫荧光法检测MC的磷酸化p38MAPK（P-p38MAPK）活性,并用ELISA检测转化生长因子-β1（TGF-β1）分泌状况。p38MAPK特异性抑制剂SB203580及不同浓度螺内酯预处理对其影响。结果：高糖激活p38MAPK,增加RMC的P-p38MAPK活性和TGF-β1的表达;SB203580显著抑制TGF-β1表达（P〈0.01）;螺内酯抑制P-p38MAPK的活化并减少TGF-β1的蛋白表达（P〈0.01）,并随浓度增高,抑制作用增强。结论：p38MAPK可能是糖尿病肾病发生的始动信号之一,螺内酯可能通过抑制p38MAPK磷酸化而减少TGF-β1分泌。     

胰岛素对糖尿病大鼠潜在皮肤病变防护作用的机理研究

目的探讨胰岛素对糖尿病潜在皮肤病变保护作用的机理。方法用链脲佐菌素(STZ)将8周龄雄性SD大鼠诱导成速发型糖尿病大鼠模型,分为应用胰岛素强化控制血糖组(A组)(n=27)和未控制血糖组(B组)(n=27),并以正常大鼠作对照(C组)(n=27),分别于致病后4、8和12周获取大鼠背部中央的皮肤标本。应用HE染色,观察皮肤组织学的改变;应用Beckman′s生化自动分析仪检测皮肤组织匀浆的糖含量;采用F3010荧光分光光度计和免疫组织化学技术测定皮肤中晚期糖基化终末产物(AGE)含量的变化;应用透射电镜观察皮肤微血管超微结构的改变。结果组织学观察,致病后12周B组糖尿病大鼠皮肤明显变薄,表皮细胞层次欠清晰,部分表皮缺乏复层排列;真皮层部分胶原萎缩、肿胀,退化变性,并伴随程度不等的炎性细胞浸润;皮下脂肪进行性萎缩或消失。A组糖尿病大鼠皮肤未出现上述明显的组织学改变。B组糖尿病大鼠皮肤糖含量在各时相点均明显高于A组和C组(P<0.01),而A组与C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。B组和A组糖尿病大鼠皮肤胶原提取液的荧光值均高于相应年龄正常大鼠,病程越长,荧光值增加越明显。8周和12周的B组糖尿病大鼠皮肤胶原提取液的荧光值明显高于同期A组的糖尿病大鼠;8周时B组为(34U/mg±4U/mg),A组为(29U/mg±3U/mg,P<0.05);12周时B组为(41U/mg±4U/mg),A组为(32U/mg±4U/mg,P<0.05)。免疫组织化学检查亦显示B组糖尿病大鼠皮肤中AGE表达阳性率于8周和12周均显著高于A组,8周时B组为32%±4%,A组为25%±5%,(P<0.05);12周时B组为39%±5%,A组为27%±4%,(P<0.05)。透射电镜观察A组糖尿病大鼠皮肤血管内皮细胞变性和基底膜增厚程度均明显好于B组。结论皮肤中AGE蓄积和高糖是糖尿病皮肤病变的重要致病因素之一,胰岛素对糖尿病大鼠潜在皮肤病变具有防护作用,其作用机制可能与严格控制血糖、抑制AGE的合成、阻断AGE的作用环节等有关。     

P38MAPK在妊娠期糖代谢异常大鼠肾脏组织中的表达

目的初步研究P38MAPK在妊娠期糖代谢异常大鼠肾脏组织中的表达水平。方法选取雌性sD大鼠60只,雄性SD大鼠15只,分为高糖高脂饮食-孕鼠组（SFP）和非孕鼠组（SFV）,普通饮食一孕鼠组（NP）和非孕鼠组（NV）。相应组分别受孕,于妊娠第20天四组大鼠心内取血,检测血糖、胰岛素水平,并计算胰岛素抵抗指数。用RT—PCR法检测大鼠肾脏组织中P38MAPK的表达水平。结果SFP组的空腹血糖值、胰岛素水平、胰岛素抵抗指数与其他三纽相比,差异均有统计学意义（P〈0．05）,证明妊娠期糖代谢异常大鼠模型建立成功;P38MAPK mRNA在肾脏组织中有表达,并且：①P38MAPKmRNA在SFP组的表达水平明显升高,与其他三组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。②P38MAPKmRNA在SFV组和NP组的表达水平均升高,但是二者之间差异无统计学意义（P〉0．05）。⑧P38MAPK mRNA在SFV组和NP组的表达水平与NV组相比升高明显,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论P38MAPK可能参与了妊娠期糖代谢异常疾病的肾脏损伤过程。     

高糖刺激人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达及与p38 MAPK信号通路关系

目的:观察高糖刺激体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的作用及其与p38信号通路(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)的关系,从而进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制.方法:培养人RPE细胞,分为对照组、高糖组、高糖 SB203580组和甘露醇组,采用四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,免疫荧光染色法观察RPE细胞中磷酸化p38 MAPK和iNOS的蛋白表达.结果:①MTT检测结果:高糖可以抑制RPE细胞增殖,加入特异性p38 MAPK抑制剂SB203580预处理后,抑制作用减弱;②免疫荧光法检测结果:与对照组相比,高糖组磷酸化p38 MAPK,iNOS蛋白表达明显增高;加入SB203580预处理后,iNOS表达被显著抑制.结论:高糖能够抑制RPE细胞增殖,通过活化p38 MAPK信号通路刺激RPE细胞iNOS的表达,在糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用.     

Effects of advanced glycation end products on renal fibrosis and oxidative stress in cultured NRK-49F cells

Background Advanced glycation end products （AGEs） play a critical role in the development of diabetic nephropathy. Reactive oxygen species （ROS） may play a critical role in AGEs induced growth factor expression. In this study, the effects of AGEs on transforming growth factor β1 （TGF-β1）, connective tissue growth factor （CTGF） and fibronectin （Fn） mRNA expression and oxidative stress in cultured NRK-49F cells were examined. Methods NRK-49F cells were incubated with medium containing different doses of AGEs （50, 100 or 200 μg/ml） for 24 hours, or with AGEs 100 μg/ml for different times （0, 12, 24 or 48 hours）. Cells in the serum-free medium or medium containing 25 mmol/L glucose were controls. Cells were treated with 25 mmol/L glucose and 100 μg/ml AGEs for 24 hours to determine the effects between AGEs and glucose. We clarified the role of antioxidant by pretreating cells with N-acetylcysteine （10 mmol/L）, ginkgo biloba extract （50 or 100 mg/L） for 24 hours and with 100 μg/ml AGEs for further 24 hours. Alamarblue dye assay was used to analyze cell growth; intracellular ROS generation was measured by flow cytometry; intracellular glutathione by fluorescence spectrophotometry; expressions of TGF-β1, CTGF and Fn mRNA by semiquantitative RT-PCR. Results AGEs significantly increased the expressions of TGF-β1, CTGF, Fn mRNA and intracellular ROS generation, and decreased the glutathion level in NRK-49F cells in dose- and time-dependent manners. High glucose and AGEs together significantly increased the expression of TGF-β1, CTGF and Fn mRNA, compared with AGEs and high glucose separately. Preincubation with N-acetylcysteine or ginkgo biloba extract increased GSH level, suppressed AGEs-induced oxidative stress and TGF-β1, CTGF and Fn mRNA overexpression. Conclusions AGEs can significantly increase expression of TGF-β1, CTGF, Fn mRNA in NRK-49F cells through enhancement of oxidative stress. The accumulation of AGEs may play a pivotal role in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Suppression of AGEs induced TGF-β1, CTGF and Fn mRNA overexpression in renal fibroblasts through inhibition of oxidative stress may be a mechanism underlying effect of ginkgo biloba extract in diabetic nephropathy. In addition, antioxidant therapy may help prevent AGEs accumulation and its induced damage.