GPC-3CTL表位表达载体构建

将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒.以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含三个不同位点磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位EYILSLEEL(EYI)的HBsAg基因片段EYI1,及替换pcHBsAg中不同CTL表位的HBsAg基因片段EYI2、EYI3;分别将EYI1、EYI2、EYI3基因片段插入pBSSK+载体中,构建出含3拷贝EYI的pBSSK/EYI1、pBSSK/EYI2、pBSSK/EYI3载体.在此基础上,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1+,构建表达EYI表位肽的DNA疫苗.真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,结果显示:成功构建了pcDNA.EYI1/HBsAg、pcDNA-EYI2/HBsAg、pcDNA-EYI3/HBsAg真核表达质粒,为进一步测定以GPC3基因为基础的HBsAg多肽候选疫苗提供理论、实验依据.

Abstract：

Objective To construct the expression vectors of GPC-3 CTL epitope. Methods The HBsAg gene with three different EYILSLEEL (EYI) sites was named EYI1, and another with one EYI replacing CTL epitope FLG or SIL of pcHBsAg were named EYI2 and EYI3, respectively. All the three DNAs were amplified by SEOing PCR from pcHBsAg plasmid and linked into pBSSK+ vector to construct pBSSK/EYI1, pBSSK/EYI2, and pBSSK/EYI3. The three plasmid were identified by PCR, double digestion and sequencing, and the fragments with EYI1-3 were obtained by double digestion and then inserted into pcDNA3.1+ vector. Results and Conclusion PCR, enzyme digestion and sequence analysis confirmed successful construction of the eukaryotic expression vectors pcDNA-EYI1/HBsAg, pcDNA-EYI2/HBsAg, pcDNA-EYD/HBsAg, which facilitate further studies of the GPC3-HBsAg multiple peptides vaccine for HBV infection.     

CEA迷你基因串联体肿瘤疫苗的构建

目的：构建人癌胚抗原（CEA）的迷你基因串联体肿瘤疫苗。方法：通过PCR从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列,其中包含两个编码辅助性T细胞（HTL）表位的迷你基因,插入pGEM-T easy载体后测序,再将目的基因以同尾酶连接的方式顺次定向亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.0中,得到三串联体,以 PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒 pc DNA3.0-triCEA_625-667。结果:PCR和酶切结果表明,获得的目的基因与所选的基因片段 CEA_625-667中包含的碱基数量吻合,且带有正确的酶切位点。测序结果与GenBank登记完 全相同。构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的经同尾酶连接的目的基因片段三倍体。结论：成功地构建了含有CEA_625-667基因三串联体的DNA疫苗。     

含变形链球菌PAcA基因的真核表达质粒pcDNA3.1-PAcA的构建与鉴定

目的 :构建含有免疫刺激序列、可防止变形链球菌在牙面粘附的DNA疫苗。方法 :利用PCR技术由质粒pPAcA CTA2 B扩增编码PAcA的DNA片段 ;通过T A克隆技术将目的DNA片段克隆于载体pMD1 8 T ,鉴定插入方向后 ,将目的DNA从载体上释放 ,再克隆于含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出用作防龋疫苗的真核表达质粒pcDNA3 .1 PAcA。结果 :通过对重组质粒pcDNA3 .1 PAcA进行酶切图谱和DNA序列测定分析 ,证明真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA构建成功、阅读框架正确。结论 :利用T A克隆等技术可成功将编码PAcA的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA。     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建

目的：构建以HBV HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒，以探讨HBV基因免疫的新途径。方法：PCR扩增HBc第1－72aa及93－183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheI/XhoI位点，构建真核表达载体pHBcdM。合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点，构建HBc-Mep融合基因真核表达质粒。经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒。结果：双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因。结论：成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc-Mep，为研究pHBc-MeP作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。     

稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体,获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆．方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct;合成HCVE2区模拟表位和NS3～NS5七个T细胞表位基因Em;分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中．用BamHⅠ／HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm,再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3,1（-）,构建重组质粒pCDNA3．1（-）-CtEm,经酶切鉴定及测序正确后,通过脂质体转染至P815细胞,持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT—PCR,IFA,Western—blot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因．结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-CtEm,建立了稳定转染的P815细胞系．结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体,稳定转染P815细胞,为进一步在疫苗研究中分析CTL功能建立了靶细胞．     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

丙型肝炎病毒NS3区C末端HLA-11限制性CTL表位的作用

目的 研究丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）非结构３区（ＮＳ３）Ｃ末端ＨＬＡ－１１限制的细胞Ｔ细胞（ＣＴＬ）表位在ＨＣＶ感染中的作用。方法 血清学方法检测３例患的ＨＬＡ分型,他们均存在ＨＬＡ－Ａ１１表型,以ＨＬＡ－１１结合基序为依据,预测了ＨＬＡ－１１限制的ＣＴＬ表位。２例慢性患５ａ内３个时间点和３ａ内２个时间点及转阴患的血清样本,用反转录ＰＣＲ扩增出ＨＣＶ基因片段,     

ENDOGENOUS EXPRESSION AND HLA STABILIZATION ASSAY OF PLASMODIUM FALCIPARUM CTL EPITOPE MINIGENE IN HUMAN HLA- A2.1 AND HLA- B51 CELLS

INTRODUCTION Malaria is responsible for 300～ 500 million morbidity per year in the endemic tropical and subtropical areas, and Plasmodium falciparum, the causative agent of the most virulent form of human malaria infections, causes about 3 million deaths. The increasing incidence of resistance to most antimalarial drugs has stimulated researches aimed at controlling this disease by vaccination. Many studies have demonstrated the critical role played by CD8＋ cytotoxic T lymphocytes (C…     

携带NR2B抗原表位的表达载体的构建与鉴定

目的构建携带N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)2B亚基抗原表位的表达载体并进行初步鉴定。方法在获得NMDAR2B(NR2B)抗原模拟表位碱基序列TCGCATCCGCCTGTGATGCCTTGGCC-TACTTCGACT的基础上,设计两条含起始密码子、终止密码子、双酶切位点的互补引物,应用PCR技术合成该表位,与表达载体pDC515重组为pDC515/nr2b,采用限制性内切酶酶切及DNA测序进行鉴定。结果经限制性酶切鉴定及DNA测序分析证实pDC515/nr2b含有NR2B抗原模拟表位片段。结论成功构建了含有NR2B模拟抗原表位的表达载体,为进一步研制NR2B抗原表位的DNA疫苗及其镇痛效应奠定了实验基础。     

PET15b-BCG HSP65-GP2重组质粒的构建与鉴定

目的:构建表达卡介苗热休克蛋白65(BCGHSP65)与人HER-2/neu细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位(GP2)构成的融合蛋白(BCG HSP65-GP2)的重组质粒.方法:将用PCR方法扩增并回收的BCGHSP65-GP2基因片段与原核表达质粒PET15b重组,经过酶谱分析筛选出正向重组质粒,DNA序列分析正向重组质粒.结果:筛选出3个正向重组质粒.结论:重组表达质粒PET15b-BCG HSP65-GP2的构建是成功的,为进一步表达奠定基础.     

沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA对乙肝疫苗HBsAg‘a’表位构象的作用研究

目的：研究沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA对乙肝疫苗HBsAg‘a’表位构象的形成作用。方法：将沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA基因克隆于PET32b载体上,与乙肝疫苗HBsAg‘a’表位载体共转BL21菌,运用流式细胞仪和荧光显微镜观察HBsAg‘a’表位构象的形成。结果：在没有沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA的情况下,HBsAg‘a’表位的正确表达率仅为29.73%,而在共转沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA的BL21菌中,HBsAg‘a’表位的正确表达率上升至59.78%,较前提高了1倍。荧光显微镜观察发现加入β-二巯基乙醇破坏二硫键的形成后,DsbA辅助形成HBsAg‘a’表位的绿色荧光也随之消失。结论：沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA能够有效促进原核细菌胞膜上HBsAg‘a’表位构象的正确形成。     

重组人乳头瘤病毒CTL表位疫苗的构建与表达

目的：构建人乳头瘤病毒的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位疫苗并在大肠杆菌中表达。方法：应用多轮PCR 的方法合成CTL表位基因序列,将其亚克隆入pET28a表达载体中,并在大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达重组蛋白质,用Western blotting对重组蛋白进行鉴定。结果：采用计算机表位预测的方法选取HPV6、11、16型的CTL表位,通过5轮PCR 人工合成人乳头瘤病毒CTL表位疫苗的基因片段HPVepi,用亚克隆的方法构建了重组表达质粒pET28a-Tat-HPVepi,并在大肠杆菌高效表达了该重组蛋白质,经Western blotting鉴定显示出特异性条带。结论：结合计算机表位预测和PCR的方法构建并在大肠杆菌中高效表达了一种人乳头瘤病毒CTL表位疫苗。     

结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201/*03限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测

目的:探寻结核分枝杆菌CFP21抗原的同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位。方法:对结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201候选肽,利用在线数据库预测HLA-A*03限制性的天然表位肽,通过氨基酸置换适当修饰获得对应的改造肽。通过T2A3细胞结合力实验筛选候选肽,用于细胞毒活性实验。结果:在线数据库预测共获得4条母体肽和3条改造肽。结合力实验显示,改造肽p134-1Y2L、p134-1Y2L9L和母体肽p134与HLA-A*03分子均具有较高的结合力。改造肽p134-1Y2L9L和母体肽p134均能诱导CTL反应,但p134诱导出的CTL对靶细胞具有更强的杀伤效应。结论:p134(AVADHVAAV)是同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱CTL表位。     

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达简

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原（HBs）嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCVAR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H—AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV—HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-s真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCVAR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24HAR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA—AR3-S构建正确,Westernblot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H—AR3和pCMV—HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。     

基于戊型肝炎病毒中和表位的基因免疫表达载体的构建与鉴定

目的：获得戊型肝炎病毒(HEV)中和表位p166的编码基因，构建基于该中和表位的HEV基因免疫的真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法从粪便标本中扩增获得HEV VOF2中G6461～G7035片段，通过比较核酸序列同源性鉴定其基因型，PCR方法扩增该片段中HEV中和表位p166的编码基因，经酶切后克隆于真核表达载体pTR421质粒，并以PCR、酶切和DNA测序加以鉴定。结果：成功克隆了p166的编码基因，其基因型别为Ⅳ型；经酶切鉴定和DNA测序证实p166的编码基因已成功插入pTR421质粒，且核酸序列、读码框架正确结论：成功构建含Ⅳ型HEV中和表位编码基因的重组质粒，为后续基于HEV中和表位基因免疫的研究奠定基础。