P27对血管平滑肌细胞增殖的调控

社会正逐步进入老龄化,血管增殖性疾病如动脉粥样硬化,经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄等发病率和死亡率逐年上升,已成为严重影响人类健康的主要疾病目前认为血管平滑肌(vascular smoth muscle cell,VSMC)的异常增殖和迁移在冠心病等血管增殖性疾病的发生发展中具有重要作用.随着分子生物学的发展,对引起VSMC异常增殖和迁移的分子学机制正在不断深入,为血管增殖性疾病的治疗提供了新的思路.通过对细胞周期素(Cyclins)和细胞周期素依赖性激酶(cyclins delay kinase,CDK)及其复合物的抑制作用来调控细胞周期的进程.对P27蛋白的研究将有助于血管增殖性疾病的治疗.本文就P27与VSMC增殖和迁移做一综述.     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

腺病毒介导gax基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化。方法　以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体 (AdCMV gax)常规转染VSMC后 ,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化 ;应用四唑盐 (MTT)比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷 ( 3H TdR)掺入试验和流式细胞仪检测观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果　①AdCMV gax转染前 ,PDGF BB下调Gax蛋白的表达 ,接近正常生理浓度的PDGF BB( 2ng ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由 3 6.42 %显著降低至 2 2 .83 %(P <0 .0 5 ) ,随着PDGF BB浓度的升高 ,gax基因表达下降程度更加显著 ;AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。②AdCMV gax转染使VSMC表达gax增强后 ,VSMC的MTT吸光度值和3H TdR掺入量均较未转染组显著降低 ,G0 G1期的VSMC比例较未转染组显著增高 (P <0 .0 1) ,G2 M期和S期细胞比例显著降低 (P <0 .0 1)。结论　增强gax基因表达可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC增殖     

低氧时NF—κB和P53在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡中的变化

对培养的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)用免疫细胞化学、western blot和原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)进行检测.免疫细胞化学染色发现无血清培养基(SFM)组中PASMC核因子-кB(NF-кB)阳性指数明显低于低氧48 h(H48h)组(P＜0.05),H48h组P53阳性指数与SFM组相比有增高趋势.增殖细胞核抗原阳性指数(PI)在SFM组明显低于H48h组(P＜0.05),SFM组抑制性-кBα(I-кBα)的含量是H48h组的2.5倍,SFM组的凋亡指数(AI)明显高于H48h组(P＜0.05);NF-кB阳性指数与AI呈负相关(r=-0.737,P＜0.05)而与PI呈正相关(r=0.802,P＜0.05).提示低氧时PASMC中NF-кB活性明显增加,表明NF-кB可能抑制PASMC的凋亡并促进其增殖;低氧时P53有增高的趋势,其对PASMC增殖和凋亡的影响可能被激活的NF-кB抑制.     

黄色素对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 研究黄色素（ＳＹ）对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的作用及其作用机制。方法 以培养的家兔ＶＳＭＣ为材料，采用细胞计数和＾３２Ｐ掺入法，研究了ＳＹ对ＶＳＭＣ的增殖及ＶＳＭＣ中酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）活性的影响。结果 ＳＹ对血清刺激的ＶＳＭＣ的增殖具有抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。１．０ｇ／Ｌ达到最大抑制，抑制率为５４．６％，４ｄ（１．０ｇ／Ｌ ＳＹ）达到最大抑制，抑制率为５２．０％，超过４ｄ     

肉桂氨茴酸对血管平滑肌细胞生长及周期蛋白P21和P53表达的影响

目的探讨肉桂氨茴酸对血管平滑肌细胞(VSMC)生长及周期蛋白P21和P53表达的影响。方法以培养的兔主动脉VSMC株为模型,应用活细胞计数进行细胞增殖和迁移检测,计算半数抑制浓度(IC50)。采用流式细胞仪分析肉桂氨菌酸作用24h后VSMC周期的变化和细胞凋亡率,以western印迹法检测细胞周期蛋白P21和P53的表达。结果20%的胎牛血清条件下,肉桂氨茴酸显著抑制VSMC的增殖和迁移,在9．6～305．8/μmol/L范围内,随剂量增加其抑制率增加。IC-(50)为75．6/μmol/L。IC-(50)的肉桂氨茴酸作用VSMC 24h后,G1期细胞数占24%,显著低于作用前的51%(P＜0．01),形成明显的亚二倍体峰,细胞凋亡率为36．7%。经IC_(50)的肉桂氨茴酸作用VSMC 24h后出现明显的P21和P53条带,而空白对照组无表达。结论肉桂氨茴酸浓度依赖性抑制VSMC的生长,其抑制作用主要通过细胞凋亡的方式。肉桂氨茴酸抑制VSMC增殖与细胞周期蛋白P21和P53的表达有关。     

卡托普利抑制实验性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖及对HSP70和P53的影响

采用氚-胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)参入法,电镜,免疫组化,原位杂交法,观察了卡托普利(Cap)对实验性高血压大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的作用及对热应激蛋白70 kd(HSP70)及其mRNA和抑癌基因P53表达的影响。结果发现:Cap在降低血压同时,能减少VSMC的线粒体、粗面内质网和~3H-TdR参入量(均为P<0.01),并能逆转VSMC增殖时HSP70及其mRNA表达增强(均P<0.01),P53抑癌基因mRNA表达减弱(P<0.05)。结果表明:Cap能抑制实验性高血压大鼠的VSMC增殖,与HSP70及P53的调控有关。     

p21抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究

目的 探讨p21基因转染诱导体外培养的人血管平滑肌细胞（HVSMC）凋亡进而抑制其增殖的可能作用机制。方法 通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,利用印迹杂交分析、荧光染色分析等对p21基因的表达、靶细胞增殖抑制及凋亡、组织型转谷氨酰胺酶（tTG)的表达进行分析。结果 外源性p21基因高水平的表达显著抑制了靶细胞的增殖（P＜0.01),tTG表达的显著升高及荧光染色检测均提示靶细胞发生了凋亡。结论 p21基因的过度表达可诱导HVSMC凋亡并能抑制其增殖,这一过程可能与tTG的高表达有关。     

长期口服卡托普利对动脉平滑肌细胞增殖能力的抑制作用

给10周龄自发性高血压大鼠(SHR)口服卡托普利(CAP)10周后,采用MTT法检测其主动脉平滑肌细胞(SMC)在体外培养环境中的增殖能力,同时用放射免疫法测定培养的SMC内血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)浓度。结果表明:长期口服CAP能抑制SHR动脉SMC的增殖能力,且该作用与细胞内Ang Ⅱ含量无关。     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞增殖与细胞凋亡的影响

目的观察同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及凋亡的影响。方法采用组织贴块法体外培养人VSMCs,将不同浓度Hcy与VSMCs孵育不同时间,应用MTT法检测VSMCs细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测VSMCs细胞凋亡。结果体外培养的人VSMCs在终浓度为500μmol/L Hcy的培养液中孵育0h、6h、12h、24h、48h后的A值分别为0．504±0．053、0．586±0．043、0．625±0．031、0．683±0．087、0．812±0．147,细胞凋亡率分别为2．39％±0．47％、2．45％±0．96％、7．58％±2．02％、13．37％±4．71％、17．69％±3．13％,表明Hcy呈时间依赖性诱导人VSMCs细胞增殖和细胞凋亡；在终浓度分别为0、100、200、500、1000μmol/L Hcy的培养液中孵育24h后的A值分别为0．549±0．067、0．616±0．121、0．644±0．095、0．685±0．139、0．846±0．142,细胞凋亡率分别为2．68％±0．23％、2．79％±0．89％、8．45％±2．41％、13．41％±4．98％、17．75％±5．56％,表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCs细胞增殖和细胞凋亡。结论Hcy可以诱导VSMCs增殖和细胞凋亡,这一双重作用可能是Hcy致动脉粥样硬化作用的机制之     

重组腺相关病毒介导的nm23H1载体的构建及鉴定

目的对载有肿瘤转移抑制基因nm23H1的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定。方法用基因重组的方法构建含全长nm23H1的重组腺相关病毒骨架质粒，利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞293细胞中，分别合成AAV-nm23H1和AAV—Laz，经PCR，DNA测序，酶切鉴定，用斑点杂交法测定重组病毒的滴度。并用重组病毒感染卵巢癌细胞测定其转染效率。结果成功构建并鉴定nm23H1，梯度均为10^10病毒分子／ml，转染效率为70％。结论构建AAV—nm23H1为临床治疗肿瘤转移提供了新的手段。     

携带野生型p53基因的重组腺病毒载体的构建

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型Ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

腺病毒介导p21基因转染抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究

目的 研究抗增殖性p21基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMC)的增殖抑制作用及其作用机制。方法 通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,通过免疫印迹法(Western blot)检测p21基因的表达,原位末端标记法(TUNEL)、DNA片段梯度分析及流式细胞分析(FCM)观察靶细胞的细胞周期变化及凋亡,利用酶联免疫光度仪分析靶细胞的增殖抑制情况。结果 Western blot结果显示p21基因转染后的HVSMC可高水平表达p21蛋白,而另两组无表达。感染后5 d,Adp21组的细胞数为0.275 5±0.01(525 nm波长下吸光度A值),AdlacZ组为0.340 9±0.02,空白组为0.347 5±0.02,Adp21组较另两组的差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL、DNA片段梯度分析及FCM检测均提示靶细胞发生了凋亡。FCM检测还发现明显的细胞周期阻滞现象,Adp21组G0-G1期细胞比例为66.23％,S期细胞比例为10.18％,而另两组G0-G1期和S期细胞比例分别为:47.73％、30.56％和45.31％、32.34％。结论 复制缺陷性腺病毒在体外可有效介导外源性p21基因转染HVSMC,转染后的细胞除发生细胞周期阻滞外还出现明显的凋亡,其生长增殖受到抑制。     

抑制人喉癌细胞生长的p53基因反转录病毒重组体的构建

野生型ｐ５３基因在细胞增殖与分化的调控过程中起着重要作用。已有研究表明，人喉癌中存在ｐ５３基因的结构异常或表达异常。本实验根据这一特点，设计出能整合在人喉癌细胞染色体上并适宜表达的野生型ｐ５３基因反转录病毒重组体Ｐｃ５３Ｎ２Ａ。通过体外实验证明，这一重组体能够以基因替代的方式，恢复ｐ５３基因的功能，抑制人喉癌细胞的生长。     

益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸血症兔平滑肌细胞增殖及MMP-9基因表达的影响

目的 探讨益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸(Hcy)血症兔平滑肌细胞增殖及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因表达的影响.方法 40只新西兰兔,随机平分为正常组、模型组、益肾活血胶囊小剂量组、益肾活血胶囊大剂量组及西药(叶酸、维生素B6、维生素B12)组,除正常组外,其他组建立高Hcy血症及动脉粥样硬化(AS)动物模型,然后分别给予相应的药物治疗.高效液相色谱技术检测血浆Hcy浓度,HE染色观察血管形态学变化,透射电镜观察血管中膜平滑肌细胞超微结构,实时定量PCR检测动脉壁MMP-9基因表达.结果 益肾活血胶囊和叶酸等维生素均可明显降低血浆Hcy水平,减轻血管内膜增度,抑制平滑肌细胞增生,下调腹主动脉MMP-9基因表达.益肾活血胶囊大剂量组疗效明显优于小剂量组和西药组.结论 益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy水平,抑制Hcy诱导的动脉粥样硬化形成,其机制可能与抑制平滑肌细胞增殖,下调MMP-9基因表达有关.     

腺病毒介导野生型p53基因对人肺腺癌细胞的抑制效应

目的：p53基因突变是人类肿瘤中常见的遗传学改变。将野生型p53基因导入一些肿瘤细胞中被证明能抑制其细胞增殖，因此做为肺癌基因治疗主要目的基因而备受关注。本研究旨在观察野生型p53基因对人肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制效应，并对其抑癌机制进行分析，为今后肺癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法：采用重组体腺病毒Ad-p53基因转染人肺腺癌细胞系GLC－82；以裸鼠皮下移植瘤治疗试验观察Ad-p53基因的抑瘤效应；用流式细胞计数，DNA片断化及TUNEL分析探讨Ad-p53基因的抑癌机制。结果：导入Ad-p53基因后人肺腺癌GLC－82细胞生长能力显著下降，克隆形成能力受到明显抑制；并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；肺癌细胞发生凋亡，并出现明显的G1期阻滞现象。结论：腺病毒介导野生型p53基因（Ad-p53)对人肺腺癌细胞和裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制效应，主要通过诱导癌细胞凋亡和参与细胞周期调控实现，进而提示Ad-p53基因有可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用。     

野生型p53基因抑制舌鳞癌细胞株Tca8113在裸鼠体内生长及增殖研究

为考察野生型ｐ５３基因转移入舌鳞癌细胞株Ｔｃａ８１１３后，癌株在裸鼠体内的生长及增殖状态，作者采用电穿孔方法分４组进行了如下基因转移：野生型ｐ５３基因，空白对照质粒，突变型ｐ５３基因和未转移任何基因的空白对照。在基因转移进入舌鳞癌细胞株Ｔｃａ８１１３后，分别接种于１６只裸鼠体内。成瘤后分别进行常规病理学、定量病理学和免疫组织化学研究。结果：转染野生型ｐ５３基因组与其余３组比较，其形成的肿瘤重量明显为轻；肿瘤异常核分裂相减少；定量病理学显示肿瘤坏死区面积所占瘤体总面积的百分比明显降低；免疫组织化学显示非坏死区增殖细胞核抗原明显更低。上述结果提示肿瘤细胞获取了功能完好的外源性野生型ｐ５３基因后，其基因表达并产生了新的负性调节因子，抑制了肿瘤的生长和增殖。并从理论上证明了利用野生型ｐ５３基因口腔粘膜鳞癌进行基因治疗是可能的。     

iNOS转基因在血管平滑肌细胞的表达

目的 研究逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）中的表达。方法 通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSNiNOS导入PA317细胞中；经G418筛选获得抗性克隆；用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度；将病毒上清转染体外培养的VSMC；采用RT-PCR、Western blot检测VSMC内iNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PLXSNiNOS转染体外培养的VSMC48h后，在VSMC内可检测到外源性iNOS mRNA和蛋白；而用PLXSN转染体外培养的VSMC48h后未能检测到外源性iNOS mRNA和蛋白表达。结论 逆转录病毒介导iN0s基因可高效转染体外培养的VSMC，并在细胞内表达iNOS蛋白。