TRP-1反义核酸转染黑素细胞 黑素瘤细胞的光镜及电镜观察

目的　观察TRP 1反义核酸真核表达载体转染的黑素细胞及黑素瘤细胞形态学改变, 探讨TRP 1功能。方法　将TRP 1反义核酸真核表达载体转染黑素细胞及黑素瘤细胞,以倒置光学显微镜及透射电镜分别观察细胞显微结构及超微结构的变化。结果　光镜下可见TRP 1反义核酸转染的黑素细胞及黑素瘤细胞树突变短粗,细胞胞体增大,呈上皮样细胞改变;电镜下可见线粒体变大,电子密度降低,溶酶体、脂滴、糖原颗粒增多,细胞核肿胀及凋亡细胞。结论　TRP 1在黑素细胞及黑素瘤细胞形态学改变中发挥重要作用,本研究为阐明TRP 1基因的功能提供较为全面的形态学证据。     

脂质体携带反义寡核苷酸对A375细胞Survivin表达的影响

目的研究脂质体携带反义寡核苷酸转染对A375细胞Survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western免疫印迹法对反义寡核苷酸转染后A375细胞Survivin mRNA和蛋白表达变化进行定性和半定量分析。结果RT-PCR结果经光密度扫描半定量分析:对照组为0.9994,反义寡核苷酸处理组为0.4761,较对照组降低了52.36%。Western免疫印迹法证实在A375细胞中存在分子量16.5KD的特异性条带,与Survivin分子量相符,反义寡核苷酸处理组细胞在NC膜上特异性条带明显弱于对照组细胞。结论证实反义寡核苷酸通过降解mRNA,阻断基因翻译成蛋白质的特异性反义活动机制。     

hTERT反义寡核苷酸抑制Hut78细胞端粒酶活性及诱导细胞凋亡的研究

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株端粒酶活性及细胞生长的影响,为CTCL基因治疗提供新的基因靶点。方法 采用脂质体介导的基因转染方法,将不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)的寡核苷酸分别导入CTCL细胞株Hut78中;分别于不同的时间,应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法(PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪技术等动态观察转染细胞中端粒酶活性、hTERT mRNA表达以及细胞凋亡的变化。结果 经hTERT反义寡核苷酸(AODN)作用72h后,细胞端粒酶的活性明显下降,hTERT mRNA的表达减弱,并可观察到细胞凋亡,凋亡细胞发生率为13.05%。细胞生长抑制作用有明显的时效性,以30μmol/L、72h时下降最明显。而有义寡核苷酸(SODN)组和对照组以上指标均无明显变化(P>0.05)。结论 hTERT反义寡核苷酸可显著抑制CTCL细胞的端粒酶活性,抑制细胞生长增殖,诱导细胞凋亡。     

存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体介导存活素反义寡核苷酸转染体外培养的角质形成细胞。采用MTT方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞生长曲线的影响;采用RT-PCR方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞存活素表达水平的影响;采用流式细胞仪检测存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞细胞周期和凋亡的影响。结果存活素反义寡核苷酸作用于角质形成细胞后,细胞增殖受到明显抑制,存活素mRNA表达水平明显下降,细胞出现明显的凋亡现象。结论存活素反义寡核苷核酸能够抑制角质形成细胞增殖,促进角质形成细胞凋亡。提示存活素可能会成为一个新的治疗银屑病的靶分子。     

微管相关蛋白2基因抑制恶性黑素瘤细胞增殖活性的研究

目的 探讨微管相关蛋白2(MAP-2)基因对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用.方法 扩增腺病毒-微管相关蛋白2(Ad-MAP-2)载体,空斑法测定Ad-MAP-2的滴度后,将Ad-MAP-2基因转染入鼠侵袭性恶性黑素瘤细胞B16C29细胞内.应用直接免疫荧光法测定细胞内MAP-2的表达,Ad-MAP-2对B16C29细胞生长的抑制作用,电镜观察细胞内微管形态,用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 Ad-MAP-2基因转染后,B16C29细胞胞体延伸出长而细的树枝状突起,近似于较成熟的色素细胞.电镜下见转染后细胞内微管含量增加,微管变长、变粗,延伸至树突,部分微管集合成束.转染后细胞增殖速度减缓,并出现凋亡.结论 MAP-2基因的表达可导致恶性黑素瘤细胞形态及微管状态的变化,抑制细胞增殖,诱导凋亡.     

反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达

目的 研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法 人表皮角质形成细胞原代培养,3~10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果 脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G₁期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸1组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论 应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.     

TRP-1编码基因反义核酸对良恶性黑素细胞凋亡的影响

目的　观察TRP 1反义核酸对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞凋亡的影响。方法　将TRP 1反义核酸真核表达载体转染至黑素细胞及恶性黑素瘤细胞 ,以透射电镜及流式细胞仪分别观察细胞的凋亡情况。结果　电镜下可见各期凋亡细胞及凋亡小体 ;流式细胞仪检测表明TRP 1反义核酸转染黑素细胞及空载体转染对照组黑素细胞的凋亡率分别为 2 4.4%及 1.2 % ,TRP 1反义核酸转染的恶性黑素瘤细胞及空载体转染对照组恶性黑素瘤细胞的凋亡率分别为7.0 %及 2 .2 %。结论　TRP 1基因在维持良、恶性黑素细胞生长方面发挥重要作用 ,其反义核酸能明显促进良恶性黑素细胞的凋亡。     

K17反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和K17表达的影响

目的研究脂质体介导角蛋白17(K17)反义寡核苷酸对培养人角质形成细胞增殖和K17表达的影响。方法利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K17寡核苷酸基因片段导入体外培养的人角质形成细胞系HaCaT,应用MTT法检测其对HaCaT细胞增殖的影响,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测K17mRNA水平的变化,并以蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学结合激光扫描共聚焦显微镜检测K17蛋白水平的改变。结果脂质体介导的K17反义寡核苷酸转染HaCaT细胞后,细胞增殖受到明显抑制,同时细胞中K17mRNA和蛋白的表达明显下降,而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无明显变化。结论应用反义技术封闭K17基因,可以阻遏角蛋白K17基因和蛋白的表达,抑制角质形成细胞的体外生长和增殖能力。     

核因子-κB反义寡核苷酸抑制紫外线诱导的HaCaT细胞反义分泌白介素6

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)反义寡核苷酸转染体外培养的HaCaT细胞反义株HaCaT后,对紫外线(UV)诱导的HaCaT细胞反义分泌炎症因子白介素6(IL-6)的抑制作用。方法 蛋白质印迹方法测定不同剂量中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞反义后NF-κBp65的变化;逆转录-聚合酶链反应测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后p65m RNA表达的变化;酶联免疫吸附测定法测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的HaCaT细胞反义分泌IL-6水平。结果 10、20、30mJ/cm² UVB辐照HaCaT细胞反义后均可显著促进NF-κBp65表达(P<0.05),不同浓度的NF-κBp65反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm² UVB诱导的p65mRNA表达和IL-6分泌均有显著抑制作用(P<0.05)。结论 脂质体介导的NF-κBp65反义寡核苷酸转染HaCaT细胞反义,可以抑制UV辐射诱导的HaCaT细胞反义产生IL-6,表明UV诱导HaCaT细胞反义产生IL-6可能是通过UV激活NF-κBp65的表达产生的。     

生存素反义寡核苷酸对人恶性黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的研究生存素反义寡核苷酸(AS-ODN)经脂质体介导转染对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法合成生存素硫代反义寡核苷酸(AS-ODN),脂质体携带转染人恶性黑素瘤A375细胞。采用台盼蓝计数、软琼脂克隆形成试验、电镜、流式细胞仪检测AS-ODN对A375细胞增殖及凋亡的影响。通过裸鼠致瘤实验观察AS-ODN对A375细胞动物体内增殖的抑制作用。结果生存素反义寡核苷酸能降低G2/M期细胞百分比,诱导细胞凋亡发生,明显抑制A375细胞的生长和克隆形成,裸鼠体内A375细胞恶性增殖潜力下降。结论脂质体介导生存素AS-ODN能有效抑制A375细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。     

Establishment and characterization of a clear-cell sarcoma (malignant melanoma of soft parts) cell line

A clear cell sarcoma (CCS) cell line, designated as NCS-1, was established in monolayer culture from a xenograft line originating from a metastatic CCS. Marked karyotypic aberrations and tumorigenicity in nude mice revealed the malignant derivation of the NCS-1 cell line. These cells contained abundant glycogen and were amelanotic by light microscopy. By electron microscopy, however, melanosomes in various developmental stages were seen, and some of them were partially melanized. The electron microscopic dopa reaction revealed the presence of tyrosinase activity. Enzyme-linked immunoadsorbent assay revealed that NCS-1 cells expressed a 75-kDa glycoprotein which was identified as a marker of highly differentiated melanoma cells. From these results, NCS-1 cells were found to retain both cytochemical and morphological properties of CCS. Application of NCS-1 cells to a panel of monoclonal antibodies recognizing melanocytic differentiation antigens showed that they corresponded approximately to highly differentiated melanoma cells. In conclusion, the present study strongly supports the close relationship between CCS and malignant melanoma.     

TRP-1编码基因反义核酸对黑素细胞增殖及功能的影响

目的 构建酪氨酸相关蛋白-1(TRP-1)反义真核表达载体并转染TRP-1高表达的黑素细胞及恶性黑素瘤细胞,进一步研究其对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞增殖及功能的影响。方法 将TRP-1基因反向亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转染黑素细胞及恶性黑素瘤细胞。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TRP-1mRNA水平的变化,免疫印迹法检测TRP-1蛋白水平的改变。通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用L-多巴测定酪氨酸酶活性的改变。结果 成功构建重组反义表达载体pcDNA3.1/TRP-1(-),转染细胞稳定表达TRP-1反义核酸。RT-PCR提示TRP-1mRNA水平显著下降,免疫印迹提示其TRP-1蛋白表达水平降低。流式细胞检测表明反义TRP-1转染细胞发生细胞周期G1期阻滞。转染组黑素细胞及黑素瘤细胞酪氨酸酶活性抑制率分别达46%和54%。结论 TRP-1在黑素细胞及黑素瘤细胞的增殖及功能方面发挥重要作用,TRP-1反义核酸转染细胞细胞周期受到阻滞,酪氨酸酶活性明显降低。     

转染反义微小RNA-155对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431生长的影响

目的 观察转染反义微小RNA?155（miRNA?155）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖、凋亡以及细胞迁移和侵袭的影响。方法 A431细胞分为3组,采用脂质体介导法转染无义序列miRNA?155（无义序列组）、反义序列 miRNA?155（反义序列组）或仅用含Lipofectamine 2000的DMEM（空白对照组）处理。实时定量聚合酶链反应检测转染后各组A431细胞miRNA?155的表达水平,噻唑蓝法检测转染后24、36、72、96、120 h细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况,Transwell法检测细胞迁移与侵袭力。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 转染后,无义序列组、反义序列组与空白对照组中A431细胞miRNA?155相对表达量分别为0.98 ± 0.02、0.28 ± 0.18、1.00 ± 0.01,3组差异有统计学意义（F = 634.57,P < 0.001）,反义序列组低于空白对照组和无义序列组,均P < 0.05。孵育72、96、120 h时,3组细胞存活率差异均有统计学意义（均P < 0.05）,反义序列组细胞存活率在3个时间点均低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）;3组细胞G0/G1期细胞比例、S期细胞比例、细胞增殖指数差异均有统计学意义（F = 23.46、36.81、19.35,P < 0.01）。反义序列组G0/G1期细胞比例（74.63% ± 2.13%）高于空白对照组（62.92% ± 2.56%）和无义序列组（63.75% ± 3.06%）,均P < 0.05;S期细胞比例及细胞增殖指数（9.88% ± 1.83%、25.36 ± 2.13）低于空白对照组（18.86% ± 2.78%、37.08 ± 2.56）和无义序列组（18.33% ± 3.72%、36.25 ± 3.06）,均P < 0.05;反义序列组迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）。结论 皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义miRNA?155可减少miRNA?155的表达,有效抑制A431细胞增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡。     

Suppression of melanoma cell proliferation by histidine decarboxylase specific antisense oligonucleotides.

Histidine decarboxylase (HDC) is expressed by the cells of melanoma, in which the histamine content tends to be relatively high. This study shows that elevated expression of HDC was found by western blot analysis of primary and metastatic melanoma tissue using a polyclonal HDC specific antibody. The specificity of anti-HDC antibody was confirmed by inhibition of HDC translation (i.e., immunopositivity) in melanoma cells by HDC-specific antisense oligonucleotide. Moreover, the decrease in proliferation caused by HDC antisense oligonucleotides indicates considerable functional relevance of histamine synthesis in melanoma growth and suggests a possible in situ application of specific antisense oligonucleotides for HDC in melanoma therapy.     

C-myc反义寡核苷酸抗恶性黑素瘤作用机制初探

目的　初步探讨C-myc反义寡核苷酸(ASODN)抗恶性黑素瘤可能作用机制。方法　以全硫代修饰的C myc反义寡核苷酸体外转染恶性黑素瘤细胞株A375,用台盼蓝活细胞计数法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期变化,间接免疫荧光流式细胞术检测HLA Ⅰ抗原的水平。结果　与对照组相比,①30μmol/LASODN组细胞生长明显受抑制,且发生G1 期阻滞;②ASODN组细胞上HLA Ⅰ抗原的水平明显上调。结论　C myc反义寡核苷酸可能通过抑制A375M细胞的增殖和上调HLA Ⅰ抗原水平的双重机制发挥抗肿瘤作用。