骨髓腔内途径脐血与间质干细胞共移植对造血重建的实验研究

目的：探讨骨髓腔内输注（IBM）脐血与间质干细胞（MSCs）对大鼠造血重建、骨髓MSCs恢复的影响，并研究供体MSCs植入状态以探讨MSCs的作用机制。方法：BrdU标记F344大鼠骨髓MSCs通过双侧胫骨IBM或尾静脉注射（IV）与胎鼠及新生大鼠外周血（FNPB）共移植Wistar雌鼠。监测受鼠存活状况、造血免疫重建、HSCs植入水平及骨髓MSCs恢复情况，并以免疫荧光法检测受鼠骨髓MSCs的来源。结果：(1)2个共移植组60 d存活率均为100%，单纯FNPB移植组仅为66.7%。(2)共移植组的外周血象、骨髓造血干祖细胞集落产率明显高于单纯FNPB移植组，尤以骨髓腔共移植组最佳。(3)2个共移植组的HSCs植入水平无统计学差异，而骨髓腔共移植组明显高于单纯FNPB移植组（P＜0.05）。(4)30 d时各移植组MSCs的增殖能力未达正常水平，但仍以骨髓腔共移植组的恢复情况最佳（P＜0.05）。(5)仅少部分受体可发现供、受体源性MSCs嵌合。 结论：脐血与MSCs共移植可促进受体骨髓MSCs恢复和造血重建，提高HSCs植入率；IBM途径应用安全，促进造血恢复的作用优于IV途径。     

羊膜脱细胞基质对脐血间质干细胞突触蛋白表达的影响

背景：天然细胞外基质对成体干细胞神经发育的影响,是目前的研究热点,国内外研究多侧重于神经标志物表达的研究,针对突触发育的研究较少。 目的：观察羊膜脱细胞基质对脐血间质干细胞突触素表达的影响。 方法：实验组将第3代人脐血间质干细胞接种在包被膜样基质盖玻片的24孔板中,以接种时开始计时,细胞以基础培养基培养4 d。对照组无膜样基质,余同实验组。苏木精-伊红染色观察细胞形态变化,免疫组化SP法检测接种第2、4天细胞突触素相关蛋白表达,RT-PCR法检测接种前和接种后第2、4天细胞突触素相关蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因转录水平的表达。 结果与结论：对照组呈成纤维细胞形态,实验组细胞突起延伸,相互连接;第2、4天实验组突触素相关蛋白表达均明显高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.01);接种前及对照组第2、4天细胞突触素相关蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因转录水平无表达,实验组第2,4天细胞突触素相关蛋白Ⅱ基因转录水平低表达,突触素相关蛋白Ⅲ弱表达,突触素相关蛋白Ⅰ不表达。结果提示羊膜脱细胞基质可以促使人脐血间质干细胞突起的产生、延伸并部分相互连接,表达突触素相关蛋白,为脐血间质干细胞神经分化提供了有利的条件。     

血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达

目的： 构建带有血管生长素-1（Ang-1）基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞（rMSCs）中的表达。方法： RT-PCR获得大鼠Ang-1基因，限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP，在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。 PCR检测Ang-1基因的插入，细胞RT-PCR检测Ang-1 mRNA表达，免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果： 所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳显示 1 512 bp Ang-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1 mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论： 成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达，为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养及基因载体特性研究

目的证实脐血中含有间充质干细胞,探讨其体外分离、培养条件,并进行生物学特性和表面抗原的鉴定,初步探索间充质干细胞作为基因治疗的载体携带目的基因的可能性及方法。方法无菌条件下取正常足月剖宫产的脐血分离、培养和纯化,获得间充质干细胞;对获得的间充质干细胞进行形态学观察;绘制生长曲线,分析间充质干细胞的增殖情况;用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原的表达情况。采用脂质体转染法将pDNA316-IRES-EGFP质粒转入间充质干细胞中,观察绿色荧光的表达以及转染后细胞生长情况。结果自脐血中成功分离获得间充质干细胞,可传代培养,经表面标志检测,表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45和HLA-DR。质粒pDNA316-IRES-EGFP通过脂质体介导转染间充质干细胞后,荧光显微镜下观察到报告基因EGFP的表达。转染后的细胞生长受到一定影响。结论人脐血来源的间充质干细胞能在体外分离、培养、扩增,并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型。EGFP基因可被成功转入间充质干细胞中并获表达。转基因间充质干细胞用于基因治疗的持久性和有效性仍需进一步研究。     

携带人端粒酶反转录酶基因脐血间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

背景：保护机体肺血管的内皮细胞,是降低肺循环压力,预防肺动脉高压的重要环节。 目的：观察携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用。 方法：体外进行脐血间充质干细胞的培养及纯化,在腺病毒介导下使人端粒酶反转录酶基因成功导入脐血间充质干细胞。将60只SD大鼠随机分成3组：肺动脉高压组、空腺病毒组、腺病毒转染组,每组20只,腹腔注射野百合碱进行肺动脉高压模型复制后,于颈内静脉分别注射1 mL的伊戈尔低糖培养基(L-DBEB),1 mL (1.5×1010 L-1)脐血间充质干细胞悬液,1 mL(1.5×1010 L-1)腺病毒介导下人端粒酶反转录酶基因转染的脐血间充质干细胞悬液。移植21 d后检测各组大鼠血流动力学水平、血浆内皮素1水平以及右心室的肥大指数。 结果与结论：各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P > 0.05);与肺动脉高压组及空腺病毒组比较,腺病毒转染组大鼠肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压均降低,差异有显著性意义(P < 0.05);腺病毒转染组大鼠右心室肥大指数与肺动脉高压组及空腺病毒组相比较,差异均无显著性意义(P > 0.05);腺病毒转染组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组及空腺病毒组,差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植后,能够改善大鼠机体血流动力学异常状态,还可以保护机体血管内皮细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人胚胎脐血间质干细胞生物学特性研究

目的:研究人中期胚胎脐血间质干细胞生物学特性,探讨其在自体宫内基因转移/治疗(IUGT)领域的应用前景。方法: 采用L-DMEM完全培养液培养中期胚胎脐血间质干细胞(MSC);流式细胞仪技术检测细胞表面标记;地塞米松/胰岛素等作为脂肪细胞诱导液,β-甘油磷酸钠/抗坏血酸等作为成骨细胞诱导液分别诱导细胞分化;将携带有绿色荧光蛋白的重组腺病毒转染MSC,荧光显微镜下检测MSC表达转基因特性;F344新生大鼠肝内注射MSC,免疫荧光检测6周后不同组织器官中人MSC存在;非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠(NOD/SCID)皮下注射MSC,病理切片检测第30 d细胞体内成瘤性。 结果:3 mL人中期胚胎脐血可以分离、培养出MSC,细胞均一地表达CD29、CD44、CD59、CD105、CD166,不表达CD34、CD45、CD80、CD86、CD42a、HLA-DR分子,体外培养中具有成脂、成骨能力;细胞表达转基因产物绿色荧光蛋白阳性率高达56.32%±3.28%;在新生大鼠体内,人中期胚胎脐血来源的MSC能向多个不同组织器官迁移,在NOD/SCID小鼠内不具有成瘤性。结论:人中期胚胎脐血MSC适合中、晚期胚胎自体IUGT靶细胞。     

Superfect 高效介导PDX-1基因在骨髓间质干细胞表达

目的：构建含有胰腺十二指肠同源框1(PDX-1)基因的真核表达载体，并提高重组载体在骨髓间质干细胞(MSCs)的表达效率，为骨髓MSCs作为糖尿病基因治疗的靶细胞奠定基础。 方法：RT-PCR体外扩增PDX-1 基因，双酶切后整合入相同双酶切的真核表达载体构建重组载体，对重组载体进行酶切分析和序列测定进行鉴定；利用Percoll 细胞分离液体外培养大鼠骨髓MSCs，流式细胞仪检测细胞周期后，Superfect 介导正确重组的载体转染骨髓 MSCs，检测转染效率和细胞存活率从而对转染条件进行优化；G418筛选阳性细胞后，RT-PCR 和Western blotting 检测PDX-1 基因在骨髓 MSCs 中的表达。 结果：重组载体双酶切分析和序列测定证实重组载体构建成功。流式细胞仪显示 85.9%的MSCs处于G₀/G₁期，提示骨髓MSCs具有强大的分化潜能；荧光显微镜下成功转染的细胞呈现全细胞绿色荧光，Superfect 介导的转染效率和细胞存活率与其绝对用量和孵育细胞的时间有关；RT-PCR显示转染后PDX-1基因在骨髓 MSCs表达，随转染时间延长，表达逐渐增强，与Western blotting结果一致。结论：成功构建了含有PDX-1 基因的真核表达载体；Superfect 能高效介导外源性基因在骨髓MSCs 中表达；转染外源性基因的MSCs可望成为一种理想的基因治疗的载体细胞。     

逆转录病毒载体介导的基因转移技术研究进展

逆转录病毒载体能稳定、高效率整合进入宿主细胞染色体基因组,并在宿主细胞内高效率的表达。这种基因转移技术为将外源基因导入哺乳动物和人细胞,从而为进行基因结构和功能,基因表达和调控,人类遗传病的基因治疗等当代分子生物学研究领域前沿问题的探讨提供了有力的手段。近年来,国外的一些实验室对逆转录病毒载体及包装细胞进行了一系列的深入研究,取得了许多重要成果。本文对了这些方面的主要进展进行了简述。     

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促胰腺癌细胞凋亡

目的研究逆转录病毒载体介导的端粒酶反义RNA促进胰腺癌细胞Can-pan-2凋亡的作用。方法通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞,G418筛选抗性细胞,获取稳定表达病毒的产病毒细胞株,以病毒上清感染Can-pan-2细胞,G418筛选获得稳定转染细胞集落并扩增培养,PCR鉴定端粒酶RNA基因的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,免疫荧光化学检测不同处理组细胞的增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡。结果两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106CFU/mL和1.1×106CFU/mL,PCR法可于约500bp处观察到目的基因的表达,反义端粒酶RNA作用后,Can-pan-2细胞端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制,并出现明显的细胞凋亡。结论反义端粒酶RNA可抑制胰腺癌细胞端粒酶活性,促进胰腺癌细胞的凋亡。     

人脐血MSCs向神经元样细胞分化过程中neurogenin1的表达变化

目的: 探讨人脐血间质干细胞(MSCs)体外向神经元样细胞分化过程中neurogenin 1的表达变化。方法: 常规从人脐血中分离MSCs,采用生长因子EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测诱导前、后神经元表面标志蛋白NF-M、NSE、胶质细胞标志蛋白GFAP和neurogenin 1的表达情况;Western blotting和RT-PCR法检测诱导前、后人脐血MSCs中neurogenin 1蛋白和mRNA的表达变化。结果: 诱导前,人脐血MSCs不表达NF-M、NSE和GFAP;诱导7 d,人脐血MSCs可以分化为神经元样细胞, 同时表达NF-M、NSE和GFAP。诱导前,人脐血MSCs不表达neurogenin 1,诱导后neurogenin 1蛋白和mRNA表达显著增加。结论: Neurogenin 1可能参与了体外诱导人脐血MSCs向神经细胞分化的过程。     

人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选

目的： 构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）慢病毒表达载体,将其转染人肝细胞L02并且通过杀稻瘟筛选出阳性克隆细胞。方法：以PBABE-puro-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因attB1- hTERT-attB2,通过BP反应克隆至pDONR221;采用LR重组酶将pDONR221-hTERT和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST- hTERT。将重组载体pLenti6/V5-DEST- hTERT与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞,获得重组慢病毒颗粒。将其感染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。结果：测序发现入门载体pDONR221包含的目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G）,通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST- hTERT成功构建。重组慢病毒滴度为1×108 TU/L,获得20株稳定抗性的单克隆细胞。结论：成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体,获得稳定抗性的单克隆肝细胞,为进一步建立永生化肝细胞系奠定了基础。     

人脐血MSCs移植修复大鼠脊髓损伤的效果及机制的初步探讨

目的　探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）移植修复大鼠脊髓损伤的作用及机制。 方法　分离纯化人脐血MSCs;制备大鼠脊髓半横断损伤模型,随机分为三组,分别在术后3 d经尾静脉注射生理盐水、培养液和BrdU标记的MSCs。移植后7、14、21、28 d,采用BBB评分法评估各组大鼠脊髓功能恢复情况;免疫荧光双标法检测MSCs在脊髓内的迁移、存活和分化,免疫组织化学法检测炎症因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和核因子（NF-κB）在脊髓损伤部位的表达规律。 结果　移植后28 d,MSCs移植组大鼠肢体功能恢复明显,与生理盐水组和培养液组比较差别有统计学意义(P＜0.05)。移植后7、14、21d,脊髓损伤区及周边均可见大量Brdu+细胞,其中BrdU+GFAP+细胞约占53.3%,BrdU+NSE+细胞约占　22.15%。相同时间点MSCs移植组HMGB1和NF-κB的阳性表达率远低于生理盐水组和培养液组,差别有统计学意义(P＜0.05)。 结论　人脐血MSCs移植后可替代损伤的神经细胞,并可减轻脊髓损伤后的炎症反应,从而促进大鼠脊髓功能的恢复。     

人脐带间充质干细胞研究进展及应用

人脐带间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。随着细胞技术的提高,人们对于脐带间充干细胞的研究越发深入,在医学的各个领域都取得了长足的进步,如脐带间充质干细胞分离技术及脐带间充质干细胞的诱导分化技术。本文就脐带间充质干细胞的生物学特性、诱导分化潜能、免疫原性进行综述,重点讨论其最新的临床应用。     

人脐血来源MSCs的主要生物学特性的研究

目的：探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）分离、纯化、扩增、表面标志、免疫表型及其造血生长因子（HGFs）分泌等生物学特性方法：(1) Ficoll法分离、纯化人脐血、成人骨髓和胎儿骨髓MSCs，动态观察不同来源MSCs的生长状况。(2) 流式细胞仪检测脐血和骨髓MSCs表面CD34、CD45、CD14、CD29、CD44、CD105、CD166、CD80、CD86、CD40和CD40L的表达。(3) ELISA法检测脐血和骨髓MSCs培养上清中SCF、TPO、FLT-3L和IL-6的分泌水平。结果：(1) 所有骨髓标本中均可分离纯化出MSCs，而15份脐血中仅4份分离纯化出MSCs，脐血MSCs和骨髓MSCs的细胞形态无明显差异,脐血MSCs原代培养所需要的单个核细胞（MNC）量为骨髓MSCs的3倍，且其原代培养的增殖速度较慢，但脐血MSCs传代培养的增殖速度和骨髓相似。(2) 脐血MSCs和骨髓MSCs表面标志无差异，均不表达造血细胞表面标志以及与免疫识别有关的表面抗原。(3) 脐血和骨髓MSCs分泌SCF、TPO、FLT-3L和IL-6的水平相似。结论： (1)脐血和骨髓同样可以分离、纯化MSCs，但脐血中MSCs的含量少，且大部分脐血中不含MSCs。(2)纯化的脐血MSCs扩增能力、表面标志、免疫学表型及HGFs分泌水平和骨髓MSCs相似。     

携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化

背景：胰岛素是成脂诱导剂的重要组成成分。然而胰岛素存在半衰期,会随着体内代谢不断灭活及降解,植入体内的细胞或材料无法像体外那样以更换培养液来达到目的。实验拟通过转染胰岛素基因,使转染后的干细胞稳定分泌胰岛素,促进其成脂分化。 目的：探讨携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后对其成脂分化能力的影响。 方法：取第3代人脐带间充质干细胞,以感染复数为20转染腺病毒载体。实验分为4组：对照组为第4代人脐带间充质干细胞;实验组1为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞;实验组2为第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液;实验组3为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液。 结果与结论：转染48 h后实验组1和实验组3的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下显现弱荧光,72 h后荧光较强。经脂肪诱导培养液培养14 d后,实验组1,2,3油红O染色后显微镜下呈红色,对照组未见脂滴形成,实验组1可见一些细小脂滴形成;实验组3与实验组2相比,脂滴大且多,定量分析显示,实验组3油红O染色阳性的面积和吸光度大于实验组2(P < 0.05)。由此说明携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后可促进其成脂能力。